【摘 要】
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目的 原核表达及纯化带GST标签的人类乳头状瘤病毒E6相关蛋白E6AP,为研究泛素化修饰与多种疾病的机制关联提供实验基础.方法 以人卵巢文库为模板,利用PCR技术扩增E6AP编码序
【机 构】
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解放军总医院第一医学中心普通外科,北京,100853;军事科学院军事医学研究院生物工程研究所,北京,100850;陆军第81集团军医院,河北张家口,075000
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目的 原核表达及纯化带GST标签的人类乳头状瘤病毒E6相关蛋白E6AP,为研究泛素化修饰与多种疾病的机制关联提供实验基础.方法 以人卵巢文库为模板,利用PCR技术扩增E6AP编码序列,将其插入pGEX?KG?GST载体中.利用DH5α感受态细胞鉴定重组质粒并大量克隆.质粒转入大肠杆菌Rossate菌株,小量诱导表达.利用GST融合蛋白纯化磁珠提取并纯化GST?E6AP融合蛋白,SDS?PAGE电泳和Western印迹检测纯化效率.结果 PCR技术成功获取大小约为2559 bp的E6AP编码序列,与pGEX?KG?GST载体连接,双酶切鉴定及公司测序结果显示GST?E6AP载体构建成功.转入Rossate菌株后诱导质粒小量表达,获取并提纯带有GST标签的E6AP重组蛋白.SDS?PAGE电泳和Western印迹结果显示E6AP蛋白纯化成功.结论 成功构建重组质粒并表达GST?E6AP蛋白,获取纯化E6AP蛋白,为进一步研究泛素化在疾病发生发展中的地位和作用奠定坚实基础.
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