【摘 要】
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[目的]本研究旨在揭示miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的作用及调控机制.[方法]分离培养蛋鸭卵泡颗粒细胞,转染miR-145-4相似物(mimic)、抑制物(inhibitor)后,利用实时荧光定量PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,采用RNAhybrid和Targetscan程序预测miR-145-4的靶基因及其与靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位a(phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA)3\'-UTR的结合位点
【机 构】
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湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,武汉430064;动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室,武汉430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,武汉430064
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[目的]本研究旨在揭示miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的作用及调控机制.[方法]分离培养蛋鸭卵泡颗粒细胞,转染miR-145-4相似物(mimic)、抑制物(inhibitor)后,利用实时荧光定量PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,采用RNAhybrid和Targetscan程序预测miR-145-4的靶基因及其与靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位a(phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA)3\'-UTR的结合位点,分别构建PIK3CA基因3\'-UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,与miR-145-4 mimic和mimic-NC共转染蛋鸭卵泡颗粒细胞后,采用双荧光素酶报告系统验证miR-145-4与靶基因PIK3CA的结合关系,最后采用实时荧光定量PCR法检测miR-145-4对蛋鸭卵泡颗粒细胞中PIK3CA基因表达的影响.[结果]实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达miR-145-4后CyclinB2基因的表达量极显著降低(P＜0.01),BCL2基因的表达量极显著增加(P＜0.01);抑制miR-145-4后,CyclinB2基因表达量极显著升高(P＜0.01),BCL2基因表达量极显著降低(P＜0.01).预测结果显示,miR-145-4与PIK3CA基因3\'-UTR存在结合位点.PCR扩增和测序结果显示,PIK3CA基因3\'-UTR的野生型和突变型载体构建成功.双荧光素酶检测结果显示,与突变型及空载体共转染组相比,野生型组双荧光素酶活性显著降低(P＜0.05),说明miR-145-4能够与PIK3CA基因3\'-UTR结合.实时荧光定量PCR结果表明,在蛋鸭卵泡颗粒细胞中过表达miR-1454后,PIK3CA基因表达量显著降低(P＜0.05),而抑制miR-145-4后,PIK3CA基因表达量极显著升高(P＜0.01).[结论]miR-145-4通过正向调控靶基因PIK3CA促进蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡,进而调控蛋鸭的卵泡发育.
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