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摘要 以采自西藏山南地区隆子县加玉乡卡布沟的红皮马铃薯为试验材料，利用植物组织培养技术进行茎尖剝离，获得脱毒苗，并建立快繁再生体系。结果表明，红皮马铃薯组织培养不同培养阶段的适宜培养基分别为分化培养基：MS + 6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.02 mg/L;继代培养基：MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.05 mg/L;生根培养基：MS + IBA 0.2 mg/L。
关键词 红皮马铃薯;脱毒;培养基;再生体系
中图分类号 S532 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0050-04
Abstract Redskinned potatoes collected from Kabugou， Jiayu Township， Longzi County of southern Tibet， were used as experimental materials to obtain virusfree seedlings by stripping the stem tips with plant tissue culture technology， and a rapid reproduction and regeneration system was established. The results showed that the suitable differentiation medium subculture medium and rooting medium was MS+6BA 0.3 mg/L+NAA 0.02 mg/L， MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L，and MS+IBA 0.2 mg/L， respectively.
Key words Redskinned potato;Virusfree; Medium;Regeneration system
西藏山南地处青藏高原冈底斯山——念青唐古拉山脉以南的雅鲁藏布江中下游，属于典型的藏南谷地，隆子县位于山南地区中偏北、喜马拉雅山东段北麓，境内属高原温带半干旱季风气候区，太阳辐射强烈，日照时间长，气温较低，昼夜温差大，干湿分明[1]。
马铃薯（Solanum tuberosum）为茄科茄属一年生草本植物，原产于南美洲安第斯山区的秘鲁和智利一带。17世纪时马铃薯传播到我国，和玉米、番薯等从美洲传入的高产作物成为老百姓的主要食品，对维持我国人口的迅速增加起到了重要作用。红皮马铃薯富含原花青素和大量微量元素，具有补血护心、防病抗病、延缓衰老、美容护肤等功效，营养价值非常突出，食疗效果非常明显。经检测，100 g马铃薯含花青素3.15 mg，粗淀粉10.07 g，蛋白质2.11 g，脂肪0.10 g，及丰富的碘、硒、锰、钾、锌等微量元素和维生素类[2-3]。西藏地区马铃薯的品质较好，很粉很甜，自古就有以马铃薯为主食的传统，其中煮食为主要方式，以土豆泥为皮，牛肉为馅的土豆包子是西藏特色美食之一[4-6]。
植物组织培养技术是目前植物生物工程中研究最为完善、应用最为广泛的领域，这一技术已经在果树、花卉、蔬菜等经济作物的快速繁殖和脱病毒等方面得到了普遍应用，并进入了产业化生产阶段[7]。马铃薯茎尖培养研究经常与获得无病毒苗结合进行，目前无病毒马铃薯苗在美国、意大利等国已应用于生产，我国从1979年开展了一系列加快优良品种繁殖的植物组织培养研究，马铃薯茎尖、茎段、叶片、叶柄再生系统也已经建立[8-10]。
笔者选用的红皮马铃薯产于西藏山南地区隆子县加玉乡卡布村，隆子卡布红皮马铃薯个头小但数量多，外皮为深红色，果肉为白色，煮后食用口感好，香味独特浓郁，薯块扎实耐贮藏，皮薄，钙和维生素C含量高，一直受到周边地县群众的喜爱。笔者利用组织培养的方法培育脱毒组培苗，为优良马铃薯品种繁育及在西藏地区的应用提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试材料。红皮马铃薯采于西藏山南地区隆子县加玉乡卡布村。
1.1.2 外植体采集。
收集西藏山南地区隆子县加玉乡卡布沟的红皮马铃薯，选择大小适中、表面光滑、完好无伤的薯块常温保存，待芽萌发后取芽，经表面消毒后，剥离茎尖，进行培养。
1.1.3 培养基及激素种类。
6-BA：6-苄氨基嘌呤，NAA：萘乙酸，IBA：吲哚丁酸。
MS基本培养基：大量元素，微量元素，有机成分，2%蔗糖，1%琼脂，pH 5～6。
1/2MS培养基：大量元素用量在MS培养基基础上减半，其他同MS培养基。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体处理。
接种前首先要进行外植体表面消毒，选取饱满的芽体，从薯块上掰下，首先用肥皂水冲洗3～5次，再用自来水冲洗15 min。然后用70%乙醇消毒，无菌水冲洗3次。将乙醇清洗后的外植体在超净工作台中再用1%升汞消毒处理，无菌水冲洗3～5次。然后马上剥茎尖。
1.2.2 试验用培养基。
红皮马铃薯的组织培养采用MS培养基作为基本培养基，再根据不同时期的具体需要添加适宜的激素。不同培养时期试验用培养基类型见表1和表2。
各种培养基配制时除添加表中所列基本培养基和激素成分外，还要添加蔗糖2%，琼脂粉1%;pH调整为5.8，分装后在121 ℃、1.1 kg/cm2的压力下灭菌20 min。
1.2.3 培养过程及培养条件。
茎尖剥离：在剥取茎尖时，把芽体置于8～40倍解剖镜下，将消毒的芽体置于无菌培养皿，一只手用镊子将其按住，另一只手用解剖针将芽鳞和叶原基分层剥离，解剖针要常蘸入90%乙醇，并用火焰灼烧进行消毒。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来后，用解剖刀片将分生组织切下来，然后将其接到培养基上（图1）。接种过程中要借助解剖镜观察，必须严格进行无菌操作，以免培养材料被污染。 分化培养：将剥离的茎尖，接种到分化培养基中，接种后置于培养室培养，培养温度控制在25 ℃左右，每天照光10 h，光强大于3 000 lx（图2）。
继代培养：分化的茎尖28 d继代一次，连续继代培养3次以上，即可以形成多丛分化苗。
生根培养：当继代苗高度大于3 cm时，由茎基部剪断接入生根培养基，7 d左右即可看到幼根，再经过14 d左右的培养，试管苗已具有发达健壮的根系，即可进行移栽。
炼苗移栽：在试管生根苗培养21 d，有3条以上的新根形成后，即可进行炼苗移栽。移栽时首先将培养瓶瓶盖去掉，炼苗3 d左右，然后进行移栽。炼苗温度为20～30 ℃。移栽时用镊子将生根苗从培养瓶中取出，用自来水将其根部的培养基冲洗干净，移入苗盘，浇足水，喷施多菌灵，转入驯化室培养，驯化室温度控制在20～25 ℃，光照3 000～5 000 lx，相对湿度90%以上。
2 结果与分析
2.1 外植体消毒
首先用肥皂水冲洗3～5次，再用流水冲洗15 min。然后用75%乙醇和1%升汞以不同消毒時间组合处理，结果发现（表3），处理①和②污染率较高，外植体萌发率较低，处理③、④、⑤污染率均非常低，达到了彻底消毒的目的，但比较外植体萌发率看，处理③萌发率为80%。综合来看，以75%乙醇消毒30 s和1%升汞消毒5 min的处理③为最佳消毒方案。
2.2 不同激素种类及浓度对外植体分化的影响
将剥离的茎尖接种到含有不同激素种类及浓度的初代培养基上，诱导分化。结果表明，接种在A2、A3 2个培养基上的外植体分化率均较高，但通过培养观察发现，A2和A3处理虽然分化率高，生长快，但分化苗细弱，A6培养基虽然分化率略低于前者，但分化的新芽生长健壮（图3、4）。在外植体分化阶段虽然希望以最快的分化速度来进行增殖，但在生产中，不能只要求有高的分化率，同时还要保证分化苗生长健壮。所以综合分析以MS + 6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.02 mg/L 的A6培养基为最适分化培养基（表4）。
2.3 不同激素种类及浓度对继代增殖的影响
选取健康、生长良好的分化苗进行继代增殖，结果发现，使用6-BA和NAA组合的培养基增殖倍数高，但激素高的组合增殖苗生长较弱。接种在A4培养基上的苗增殖率最高，增值倍数为405，接种在A5培养基的苗增殖率次之，增殖倍数为355，而其他培养基上的增殖苗生长均明显较弱。继代培养阶段不能只要求有高的分化率，同时还要保证分化苗生长健壮，综合增殖倍数与增殖苗生长状况分析，A8培养基既可以保证较高的增殖倍数，苗的生长又比较健壮，因此继代增殖培养基以MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.05 mg/L较好（表5）。
2.4 不同激素种类及浓度对试管苗生根的影响
将健壮的增殖继代苗接种到含有不同激素种类及浓度的生根培养基上培养，诱导分化苗生根。结果发现，添加NAA后，愈伤产生的数量较多，新根数量虽多，但不能形成健康良好的根系，移栽不易成活;而添加IBA的处理产生愈伤较少，但IBA浓度较大时根系粗大脆弱;综合分析认为以MS为基本培养基，添加IBA 0.2 mg/L的B3培养基诱导生根的效果最好（表6、图5～6）。
3 结论
自2015年我国马铃薯主粮化以来，马铃薯栽培面积不断扩大，市场潜力巨大。在昌果红皮马铃薯成功销往全国的带动下，山南地区开始大力推广红皮马铃薯种植，由于种植面积迅速增加，红皮马铃薯种苗需求量也急剧增加，培育马铃薯脱毒苗已成为解决种苗问题的关键[6]。
该研究以采自西藏山南地区隆子县加玉乡卡布沟的红皮马铃薯为试验材料，利用茎尖脱毒技术，获得茎尖脱毒苗，建立快繁再生系统，结果表明，适宜红皮马铃薯脱毒苗不同培养阶段的培养基分别为分化培养基：MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.02 mg/L;继代培养基：MS+6-BA 0.2 mg/L+ NAA 005 mg/L;生根培养基：MS+IBA 0.2 mg/L。而1976年中国科学院遗传研究所成功培养2个马铃薯品种的茎尖脱毒苗，初代培养基采用MS附加0.8 mg/L GA3[9]，张玲[8]在马铃薯组织培养技术研究中，芽诱导培养基采用MS+6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.2 mg/L[8]，与该试验有所不同，属于不同品种的培养差异。不同培养阶段的培养基，激素浓度都不是很高，但脱毒苗生长良好，如果用于生产则可以降低生产成本，提高收益。
参考文献
[1] 宋善允，王鹏祥.西藏气候[M].北京：气象出版社，2013.
[2] 杨文玺.马铃薯生长发育与环境[M].武汉：武汉大学出版社，2015.
[3] 原霁虹，韩黎明，尹彩云.马铃薯生产技术[M].武汉：武汉大学出版社，2015.
[4] 许娟妮.西藏自治区马铃薯生产现状及发展对策[J].现代农业科技，2017（10）：102.
[5] 许娟妮.西藏马铃薯地方资源收集与评价[J].现代农业科技，2014（8）：114，118.
[6] 赵林，牛继平，魏治镭.西藏自治区昌都市马铃薯产业发展现状、问题及对策[J].中国种业，2017（9）：39-40.
[7] 安利佳，姜长阳.植物组织培养导论[M].大连：辽宁师范大学出版社，1996.
[8]张玲.马铃薯组织培养技术研究[J].西南科技大学学报，2004，19（1）：88-90.
[9] 司怀军，王蒂，戴朝曦，等.我国马铃薯组织和细胞培养研究进展[J].中国马铃薯，2000，14（4）：220-224.
[10] 白云，马箭超，聂文丹，等.一种简易快速获得脱毒马铃薯幼苗的方法[J].河北师范大学学报（自然科学版），2017，41（2）：169-171.
关键词 红皮马铃薯;脱毒;培养基;再生体系
中图分类号 S532 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0050-04
Abstract Redskinned potatoes collected from Kabugou， Jiayu Township， Longzi County of southern Tibet， were used as experimental materials to obtain virusfree seedlings by stripping the stem tips with plant tissue culture technology， and a rapid reproduction and regeneration system was established. The results showed that the suitable differentiation medium subculture medium and rooting medium was MS+6BA 0.3 mg/L+NAA 0.02 mg/L， MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L，and MS+IBA 0.2 mg/L， respectively.
Key words Redskinned potato;Virusfree; Medium;Regeneration system
西藏山南地处青藏高原冈底斯山——念青唐古拉山脉以南的雅鲁藏布江中下游，属于典型的藏南谷地，隆子县位于山南地区中偏北、喜马拉雅山东段北麓，境内属高原温带半干旱季风气候区，太阳辐射强烈，日照时间长，气温较低，昼夜温差大，干湿分明[1]。
马铃薯（Solanum tuberosum）为茄科茄属一年生草本植物，原产于南美洲安第斯山区的秘鲁和智利一带。17世纪时马铃薯传播到我国，和玉米、番薯等从美洲传入的高产作物成为老百姓的主要食品，对维持我国人口的迅速增加起到了重要作用。红皮马铃薯富含原花青素和大量微量元素，具有补血护心、防病抗病、延缓衰老、美容护肤等功效，营养价值非常突出，食疗效果非常明显。经检测，100 g马铃薯含花青素3.15 mg，粗淀粉10.07 g，蛋白质2.11 g，脂肪0.10 g，及丰富的碘、硒、锰、钾、锌等微量元素和维生素类[2-3]。西藏地区马铃薯的品质较好，很粉很甜，自古就有以马铃薯为主食的传统，其中煮食为主要方式，以土豆泥为皮，牛肉为馅的土豆包子是西藏特色美食之一[4-6]。
植物组织培养技术是目前植物生物工程中研究最为完善、应用最为广泛的领域，这一技术已经在果树、花卉、蔬菜等经济作物的快速繁殖和脱病毒等方面得到了普遍应用，并进入了产业化生产阶段[7]。马铃薯茎尖培养研究经常与获得无病毒苗结合进行，目前无病毒马铃薯苗在美国、意大利等国已应用于生产，我国从1979年开展了一系列加快优良品种繁殖的植物组织培养研究，马铃薯茎尖、茎段、叶片、叶柄再生系统也已经建立[8-10]。
笔者选用的红皮马铃薯产于西藏山南地区隆子县加玉乡卡布村，隆子卡布红皮马铃薯个头小但数量多，外皮为深红色，果肉为白色，煮后食用口感好，香味独特浓郁，薯块扎实耐贮藏，皮薄，钙和维生素C含量高，一直受到周边地县群众的喜爱。笔者利用组织培养的方法培育脱毒组培苗，为优良马铃薯品种繁育及在西藏地区的应用提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试材料。红皮马铃薯采于西藏山南地区隆子县加玉乡卡布村。
1.1.2 外植体采集。
收集西藏山南地区隆子县加玉乡卡布沟的红皮马铃薯，选择大小适中、表面光滑、完好无伤的薯块常温保存，待芽萌发后取芽，经表面消毒后，剥离茎尖，进行培养。
1.1.3 培养基及激素种类。
6-BA：6-苄氨基嘌呤，NAA：萘乙酸，IBA：吲哚丁酸。
MS基本培养基：大量元素，微量元素，有机成分，2%蔗糖，1%琼脂，pH 5～6。
1/2MS培养基：大量元素用量在MS培养基基础上减半，其他同MS培养基。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体处理。
接种前首先要进行外植体表面消毒，选取饱满的芽体，从薯块上掰下，首先用肥皂水冲洗3～5次，再用自来水冲洗15 min。然后用70%乙醇消毒，无菌水冲洗3次。将乙醇清洗后的外植体在超净工作台中再用1%升汞消毒处理，无菌水冲洗3～5次。然后马上剥茎尖。
1.2.2 试验用培养基。
红皮马铃薯的组织培养采用MS培养基作为基本培养基，再根据不同时期的具体需要添加适宜的激素。不同培养时期试验用培养基类型见表1和表2。
各种培养基配制时除添加表中所列基本培养基和激素成分外，还要添加蔗糖2%，琼脂粉1%;pH调整为5.8，分装后在121 ℃、1.1 kg/cm2的压力下灭菌20 min。
1.2.3 培养过程及培养条件。
茎尖剥离：在剥取茎尖时，把芽体置于8～40倍解剖镜下，将消毒的芽体置于无菌培养皿，一只手用镊子将其按住，另一只手用解剖针将芽鳞和叶原基分层剥离，解剖针要常蘸入90%乙醇，并用火焰灼烧进行消毒。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来后，用解剖刀片将分生组织切下来，然后将其接到培养基上（图1）。接种过程中要借助解剖镜观察，必须严格进行无菌操作，以免培养材料被污染。 分化培养：将剥离的茎尖，接种到分化培养基中，接种后置于培养室培养，培养温度控制在25 ℃左右，每天照光10 h，光强大于3 000 lx（图2）。
继代培养：分化的茎尖28 d继代一次，连续继代培养3次以上，即可以形成多丛分化苗。
生根培养：当继代苗高度大于3 cm时，由茎基部剪断接入生根培养基，7 d左右即可看到幼根，再经过14 d左右的培养，试管苗已具有发达健壮的根系，即可进行移栽。
炼苗移栽：在试管生根苗培养21 d，有3条以上的新根形成后，即可进行炼苗移栽。移栽时首先将培养瓶瓶盖去掉，炼苗3 d左右，然后进行移栽。炼苗温度为20～30 ℃。移栽时用镊子将生根苗从培养瓶中取出，用自来水将其根部的培养基冲洗干净，移入苗盘，浇足水，喷施多菌灵，转入驯化室培养，驯化室温度控制在20～25 ℃，光照3 000～5 000 lx，相对湿度90%以上。
2 结果与分析
2.1 外植体消毒
首先用肥皂水冲洗3～5次，再用流水冲洗15 min。然后用75%乙醇和1%升汞以不同消毒時间组合处理，结果发现（表3），处理①和②污染率较高，外植体萌发率较低，处理③、④、⑤污染率均非常低，达到了彻底消毒的目的，但比较外植体萌发率看，处理③萌发率为80%。综合来看，以75%乙醇消毒30 s和1%升汞消毒5 min的处理③为最佳消毒方案。
2.2 不同激素种类及浓度对外植体分化的影响
将剥离的茎尖接种到含有不同激素种类及浓度的初代培养基上，诱导分化。结果表明，接种在A2、A3 2个培养基上的外植体分化率均较高，但通过培养观察发现，A2和A3处理虽然分化率高，生长快，但分化苗细弱，A6培养基虽然分化率略低于前者，但分化的新芽生长健壮（图3、4）。在外植体分化阶段虽然希望以最快的分化速度来进行增殖，但在生产中，不能只要求有高的分化率，同时还要保证分化苗生长健壮。所以综合分析以MS + 6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.02 mg/L 的A6培养基为最适分化培养基（表4）。
2.3 不同激素种类及浓度对继代增殖的影响
选取健康、生长良好的分化苗进行继代增殖，结果发现，使用6-BA和NAA组合的培养基增殖倍数高，但激素高的组合增殖苗生长较弱。接种在A4培养基上的苗增殖率最高，增值倍数为405，接种在A5培养基的苗增殖率次之，增殖倍数为355，而其他培养基上的增殖苗生长均明显较弱。继代培养阶段不能只要求有高的分化率，同时还要保证分化苗生长健壮，综合增殖倍数与增殖苗生长状况分析，A8培养基既可以保证较高的增殖倍数，苗的生长又比较健壮，因此继代增殖培养基以MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.05 mg/L较好（表5）。
2.4 不同激素种类及浓度对试管苗生根的影响
将健壮的增殖继代苗接种到含有不同激素种类及浓度的生根培养基上培养，诱导分化苗生根。结果发现，添加NAA后，愈伤产生的数量较多，新根数量虽多，但不能形成健康良好的根系，移栽不易成活;而添加IBA的处理产生愈伤较少，但IBA浓度较大时根系粗大脆弱;综合分析认为以MS为基本培养基，添加IBA 0.2 mg/L的B3培养基诱导生根的效果最好（表6、图5～6）。
3 结论
自2015年我国马铃薯主粮化以来，马铃薯栽培面积不断扩大，市场潜力巨大。在昌果红皮马铃薯成功销往全国的带动下，山南地区开始大力推广红皮马铃薯种植，由于种植面积迅速增加，红皮马铃薯种苗需求量也急剧增加，培育马铃薯脱毒苗已成为解决种苗问题的关键[6]。
该研究以采自西藏山南地区隆子县加玉乡卡布沟的红皮马铃薯为试验材料，利用茎尖脱毒技术，获得茎尖脱毒苗，建立快繁再生系统，结果表明，适宜红皮马铃薯脱毒苗不同培养阶段的培养基分别为分化培养基：MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.02 mg/L;继代培养基：MS+6-BA 0.2 mg/L+ NAA 005 mg/L;生根培养基：MS+IBA 0.2 mg/L。而1976年中国科学院遗传研究所成功培养2个马铃薯品种的茎尖脱毒苗，初代培养基采用MS附加0.8 mg/L GA3[9]，张玲[8]在马铃薯组织培养技术研究中，芽诱导培养基采用MS+6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.2 mg/L[8]，与该试验有所不同，属于不同品种的培养差异。不同培养阶段的培养基，激素浓度都不是很高，但脱毒苗生长良好，如果用于生产则可以降低生产成本，提高收益。
参考文献
[1] 宋善允，王鹏祥.西藏气候[M].北京：气象出版社，2013.
[2] 杨文玺.马铃薯生长发育与环境[M].武汉：武汉大学出版社，2015.
[3] 原霁虹，韩黎明，尹彩云.马铃薯生产技术[M].武汉：武汉大学出版社，2015.
[4] 许娟妮.西藏自治区马铃薯生产现状及发展对策[J].现代农业科技，2017（10）：102.
[5] 许娟妮.西藏马铃薯地方资源收集与评价[J].现代农业科技，2014（8）：114，118.
[6] 赵林，牛继平，魏治镭.西藏自治区昌都市马铃薯产业发展现状、问题及对策[J].中国种业，2017（9）：39-40.
[7] 安利佳，姜长阳.植物组织培养导论[M].大连：辽宁师范大学出版社，1996.
[8]张玲.马铃薯组织培养技术研究[J].西南科技大学学报，2004，19（1）：88-90.
[9] 司怀军，王蒂，戴朝曦，等.我国马铃薯组织和细胞培养研究进展[J].中国马铃薯，2000，14（4）：220-224.
[10] 白云，马箭超，聂文丹，等.一种简易快速获得脱毒马铃薯幼苗的方法[J].河北师范大学学报（自然科学版），2017，41（2）：169-171.