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摘要：通过对安徽省各地辣椒疫霉菌对甲霜灵抗性进行监测和室内抗性诱导，结果发现：野生辣椒疫霉菌株中敏感、中抗和抗性菌株分别占63.2％、30.4％和6.4％，说明敏感菌株是安徽省辣椒疫霉菌的优势种群，但EC20测定结果表明安徽的辣椒疫霉菌对甲霜灵的敏感性群体水平上已出现不同程度的分化；室内药剂直接诱变容易获得抗性突变株，且抗性水平可较其敏感亲本高近1000倍，说明辣椒疫霉菌对甲霜灵存在较大的抗药性风险，据此，讨论了相应的抗药性治理对策。
关键词：辣椒疫霉菌 甲霜灵 抗药性 治理
疫霉菌是一类重要的植物病原菌，由其引起的植物病害统称为疫病，常给农业生产带来重大损失。化学防治是防治疫病的主要方法，甲霜灵(metalaxyl)属苯基酰胺类杀菌剂。对疫病有特效，但由于该类药剂属于特异性位点抑制剂，对病原菌作用位点单一，病菌容易对其产生抗药性突变。该药剂于20世纪70年代末首次在欧洲使用，1980年即在爱尔兰、芬兰等地检测到致病疫霉菌(Phytophthora infestans)的抗甲霜灵菌株，此后，由于该药剂长期大面积使用，疫霉菌对其抗性也越来越重，且抗药性发生速度快、抗性水平高。国内外均发现辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)在田间对甲霜灵产生了抗性，其中江西省田间的抗性辣椒疫霉菌株占55.6％，吉林省通化地区占78.4％。辣椒疫霉菌株经室内化学诱变易发生抗药性突变，对甲霜灵产生抗性。以上研究背景提示，甲霜灵用于防治辣椒疫病具有潜在抗药性风险。但有关田间条件下辣椒疫霉菌对甲霜灵产生抗性的监测和风险鲜见报道。本文报道了安徽省各地辣椒疫霉菌对甲霜灵的抗性监测结果，以期为辣椒疫病防治、辣椒疫霉菌对甲霜灵潜在抗药性的风险评估和治理提供理论依据。
1、材料与方法
1.1供试菌株
分别从安徽省阜阳、合肥、六安、和县等16个县(市、区)多点采集辣椒疫病典型病株，进行室内分离、纯化、培养，共获得辣椒疫病菌株125株，经鉴定均为辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)菌株。以四川邛崃菌株(SCOL)为对照。
1.2供试药剂
供试药剂为91.2％甲霜灵原药，由江苏宝灵化工公司生产。先用少量丙酮溶解，再用灭菌蒸馏水配成5 mg/mL的母液备用。
1.3培养基
菌株分离选用的是含有100ug/mL氨苄青霉素、50ug/mL利福平和50ug/mL PCNB(五氯硝基苯)的选择性胡萝卜培养基(SCA)，菌株保存及试验对照所用的是胡萝卜培养基(CA)，测定ECm时选用的是含有甲霜灵不同浓度梯度的胡萝卜培养基。各种培养基按马国胜的方法配制。
1.4供试菌株对甲霜灵敏感性及抗性水平测定
1.4.1对甲霜灵敏感性测定采取生长速率法，在CA平板上培养7d的菌落边缘取直径5mm的菌丝块，分别移到含甲霜灵0、5和100ug/L的CA平板中央，置于25℃条件下培养，5d后测定菌落生长量，每处理重复3次。
抗性测定标准：菌株在含5ug/mL甲霜灵CA上的生长量≤在空白CA上生长量的40％的为敏感(MS－Metalaxyl Sensitive)；在含100ug/mL甲霜灵的CA上的生长量≥在空白CA上生长量的40％的为抗性(MR－Metalaxyl Resistant)；在含100ug/mL甲霜灵CA上的生长量<在空白CA上生长量的40％<含5ug/mL甲霜灵CA上的生长量，为中抗(MI－Metalaxyl Intermediate)。
1.4.2抗性水平测定根据1.4.1测定的结果，将抗性和中度抗性菌株分别移到含甲霜灵0、2,5、5、10、20、40、80、160ug/L的CA平板上，敏感菌株分别移到含甲霜灵0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0ug/mL的CA平板上。置于25℃条件下培养，5d后测定菌落生长量，每处理重复3次。通过菌丝生长抑制几率值和甲霜灵的浓度对数之间的线性回归分析，求出各菌株的EC50值，以敏感菌株SCOL为对照，以抗性菌株的EC50值与敏感菌株的EC50值之比计算各抗性菌株的抗性水平。
1.5供试菌株抗甲霜灵诱变及其抗性水平测定
抗药性诱变参照高智谋等的方法，将供试菌株在CA平板上25℃下培养5d，再移入含甲霜灵10ug/mL的CA平板上诱变。每培养皿接种4块大小约10mm×10mm×3mm的菌丝块，每菌株接种10个培养皿。接种后的培养皿用Parafilm封口。置25℃黑暗中培养。7d后每隔2～3d观察菌丝块生长情况，当供试菌株在CA平板上产生快速生长角变区后，再将角变区转至含10ug/mL的甲霜灵CA平板上，连续转移3～4次，均能较好生长的菌株即为抗性菌株。抗性水平参照1.4.2的方法。分别测定敏感亲本及抗性突变株对甲霜灵的EC50值，并以各自亲本为对照。求出各抗性突变株的抗药性水平。
2、结果与分析
2.1安徽省辣椒疫霉菌对甲霜灵敏感性测定
通过对供试各菌株的EC50值统计表明。不同来源地的菌株对甲霜灵的敏感性存在显著差异，其中来自安徽居巢、肥西两地的菌株全部表现为对甲霜灵敏感，其余地区的菌株则出现不同程度的分化(表1)。以已知野生型敏感菌株SCOL为对照，计算供试 8个MR菌株的抗性倍数，结果表明。来自和县和砀山的抗性菌株所占比例最大、抗性水平最高，其中抗性菌株比例占1/3，最高抗性倍数均在100倍左右(表2)。
2.3辣椒疫霉菌抗甲霜灵诱变及其抗性水平测定
供试敏感菌株在含甲霜灵10ug/mL的CA平板上生长14～21d后，多数菌株能产生快速生长角变区。将各菌株的快速角变区连续转移至含有同浓度的甲霜灵CA平板时，有部分菌落会继续产生快速角变区(说明其抗性水平仍在增加)，部分菌株生长缓慢，另有约50％的菌落能较好地生长。连续转移3—4次后在含10ug/L的CA平板上生长良好的菌株(MRLA－1、MRFN－8和MRQL－3)即为抗甲霜灵菌株。通过测定上述抗性突变株及其亲本的EC50值，发现抗性突变株的抗性倍数较高，其中MRLA－1菌株较其敏感亲本高出了约954倍。详见表3。
3、讨论与结论
本研究发现，室内诱导易获得辣椒疫霉菌抗甲霜灵突变株，且抗性水平高，说明辣椒疫霉菌对甲霜灵存在较大的抗性风险；敏感菌株目前仍是安徽辣椒疫霉菌的优势种群，但安徽各菌株对甲霜灵的敏感程度已出现分化。其中抗性菌株比例、抗性水平较高的菌株主要出现在和县、砀山等蔬菜基地。抗性菌株的产生可能与甲霜灵的使用频率和剂量有关，这些地方已连续多年使用，长期多次使用能增加病原菌对药剂的选择压力。从而加速抗性的产生。
目前，在尚无理想的抗病品种的情况下，用药防治仍是控制植物病害的主要措施，但抗药性问题已成为生产上的一个突出问题。在抗药性大面积产生前进行抗药性风险评估对指导防治具有重要作用。通常，评价植物病原菌对一个杀菌剂的抗药性风险主要是通过实验室和田间的诱变或筛选获得抗药菌株，再对抗药菌株进行抗药水平、抗药菌株获得的难易程度及抗药突变频率、抗药性治理的难易等进行综合评价。本研究表明，虽然敏感菌株依然是安徽省辣椒疫霉菌的优势种群。但已有36.8％的田间菌株对甲霜灵产生了抗性，抗性倍数最高超过100倍：同时，本试验证明。在室内用药剂直接诱变，能较易地获得抗甲霜灵突变株，且抗性菌株对甲霜灵的抗性可高达其敏感亲本的近1000倍，表明甲霜灵等苯基酰胺类杀菌剂的使用存在一定的抗药风险。
目前防治辣椒疫病的内吸性杀菌剂主要有苯基酰胺类(甲霜灵、恶霜灵、甲呋酰胺、苯霜灵等)、吗啉类(烯酰吗啉、氟吗啉等)、氨基甲酸酯类(霜霉威等)、烷基磷酸盐类(乙磷铝等)及乙酰胺类(霜脲氰等)等杀菌剂。由于甲霜灵在内吸性、生物活性和持效期等方面均优于其他苯基酰胺类杀菌剂。因此，作为防治辣椒疫病的有效药剂之一，弃之不用是不现实的，关键是如何降低抗药性风险、延长其使用年限。有报道表明，甲霜灵等苯基酰胺类杀菌剂间具有交互抗性。霜脲氰与苯基酰胺类间有负交互抗性㈣，但烯酰吗啉、乙磷铝、霜脲氰等与苯基酰胺类无交互抗性。根据安徽省辣椒疫霉菌对甲霜灵的抗性水平及分布情况，笔者建议：一方面。要继续监测辣椒疫霉菌抗药性的变化。并在抗药性发生初期及时改变防治策略和用药方法。特别是有计划地用上述无交互抗性的多种药剂进行交替使用，同时要避免使用甲霜灵单剂。并尽量降低其使用频率和剂量；对抗性频率较高的地区(如和县、砀山等地)则最好暂停使用苯基酰胺类杀菌剂，以降低选择压力，最大限度地阻止抗药性发展蔓延。另一方面，要加强肥水管理，注重健身栽培，提高辣椒对疫病的抵抗能力。
关键词：辣椒疫霉菌 甲霜灵 抗药性 治理
疫霉菌是一类重要的植物病原菌，由其引起的植物病害统称为疫病，常给农业生产带来重大损失。化学防治是防治疫病的主要方法，甲霜灵(metalaxyl)属苯基酰胺类杀菌剂。对疫病有特效，但由于该类药剂属于特异性位点抑制剂，对病原菌作用位点单一，病菌容易对其产生抗药性突变。该药剂于20世纪70年代末首次在欧洲使用，1980年即在爱尔兰、芬兰等地检测到致病疫霉菌(Phytophthora infestans)的抗甲霜灵菌株，此后，由于该药剂长期大面积使用，疫霉菌对其抗性也越来越重，且抗药性发生速度快、抗性水平高。国内外均发现辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)在田间对甲霜灵产生了抗性，其中江西省田间的抗性辣椒疫霉菌株占55.6％，吉林省通化地区占78.4％。辣椒疫霉菌株经室内化学诱变易发生抗药性突变，对甲霜灵产生抗性。以上研究背景提示，甲霜灵用于防治辣椒疫病具有潜在抗药性风险。但有关田间条件下辣椒疫霉菌对甲霜灵产生抗性的监测和风险鲜见报道。本文报道了安徽省各地辣椒疫霉菌对甲霜灵的抗性监测结果，以期为辣椒疫病防治、辣椒疫霉菌对甲霜灵潜在抗药性的风险评估和治理提供理论依据。
1、材料与方法
1.1供试菌株
分别从安徽省阜阳、合肥、六安、和县等16个县(市、区)多点采集辣椒疫病典型病株，进行室内分离、纯化、培养，共获得辣椒疫病菌株125株，经鉴定均为辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)菌株。以四川邛崃菌株(SCOL)为对照。
1.2供试药剂
供试药剂为91.2％甲霜灵原药，由江苏宝灵化工公司生产。先用少量丙酮溶解，再用灭菌蒸馏水配成5 mg/mL的母液备用。
1.3培养基
菌株分离选用的是含有100ug/mL氨苄青霉素、50ug/mL利福平和50ug/mL PCNB(五氯硝基苯)的选择性胡萝卜培养基(SCA)，菌株保存及试验对照所用的是胡萝卜培养基(CA)，测定ECm时选用的是含有甲霜灵不同浓度梯度的胡萝卜培养基。各种培养基按马国胜的方法配制。
1.4供试菌株对甲霜灵敏感性及抗性水平测定
1.4.1对甲霜灵敏感性测定采取生长速率法，在CA平板上培养7d的菌落边缘取直径5mm的菌丝块，分别移到含甲霜灵0、5和100ug/L的CA平板中央，置于25℃条件下培养，5d后测定菌落生长量，每处理重复3次。
抗性测定标准：菌株在含5ug/mL甲霜灵CA上的生长量≤在空白CA上生长量的40％的为敏感(MS－Metalaxyl Sensitive)；在含100ug/mL甲霜灵的CA上的生长量≥在空白CA上生长量的40％的为抗性(MR－Metalaxyl Resistant)；在含100ug/mL甲霜灵CA上的生长量<在空白CA上生长量的40％<含5ug/mL甲霜灵CA上的生长量，为中抗(MI－Metalaxyl Intermediate)。
1.4.2抗性水平测定根据1.4.1测定的结果，将抗性和中度抗性菌株分别移到含甲霜灵0、2,5、5、10、20、40、80、160ug/L的CA平板上，敏感菌株分别移到含甲霜灵0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0ug/mL的CA平板上。置于25℃条件下培养，5d后测定菌落生长量，每处理重复3次。通过菌丝生长抑制几率值和甲霜灵的浓度对数之间的线性回归分析，求出各菌株的EC50值，以敏感菌株SCOL为对照，以抗性菌株的EC50值与敏感菌株的EC50值之比计算各抗性菌株的抗性水平。
1.5供试菌株抗甲霜灵诱变及其抗性水平测定
抗药性诱变参照高智谋等的方法，将供试菌株在CA平板上25℃下培养5d，再移入含甲霜灵10ug/mL的CA平板上诱变。每培养皿接种4块大小约10mm×10mm×3mm的菌丝块，每菌株接种10个培养皿。接种后的培养皿用Parafilm封口。置25℃黑暗中培养。7d后每隔2～3d观察菌丝块生长情况，当供试菌株在CA平板上产生快速生长角变区后，再将角变区转至含10ug/mL的甲霜灵CA平板上，连续转移3～4次，均能较好生长的菌株即为抗性菌株。抗性水平参照1.4.2的方法。分别测定敏感亲本及抗性突变株对甲霜灵的EC50值，并以各自亲本为对照。求出各抗性突变株的抗药性水平。
2、结果与分析
2.1安徽省辣椒疫霉菌对甲霜灵敏感性测定
通过对供试各菌株的EC50值统计表明。不同来源地的菌株对甲霜灵的敏感性存在显著差异，其中来自安徽居巢、肥西两地的菌株全部表现为对甲霜灵敏感，其余地区的菌株则出现不同程度的分化(表1)。以已知野生型敏感菌株SCOL为对照，计算供试 8个MR菌株的抗性倍数，结果表明。来自和县和砀山的抗性菌株所占比例最大、抗性水平最高，其中抗性菌株比例占1/3，最高抗性倍数均在100倍左右(表2)。
2.3辣椒疫霉菌抗甲霜灵诱变及其抗性水平测定
供试敏感菌株在含甲霜灵10ug/mL的CA平板上生长14～21d后，多数菌株能产生快速生长角变区。将各菌株的快速角变区连续转移至含有同浓度的甲霜灵CA平板时，有部分菌落会继续产生快速角变区(说明其抗性水平仍在增加)，部分菌株生长缓慢，另有约50％的菌落能较好地生长。连续转移3—4次后在含10ug/L的CA平板上生长良好的菌株(MRLA－1、MRFN－8和MRQL－3)即为抗甲霜灵菌株。通过测定上述抗性突变株及其亲本的EC50值，发现抗性突变株的抗性倍数较高，其中MRLA－1菌株较其敏感亲本高出了约954倍。详见表3。
3、讨论与结论
本研究发现，室内诱导易获得辣椒疫霉菌抗甲霜灵突变株，且抗性水平高，说明辣椒疫霉菌对甲霜灵存在较大的抗性风险；敏感菌株目前仍是安徽辣椒疫霉菌的优势种群，但安徽各菌株对甲霜灵的敏感程度已出现分化。其中抗性菌株比例、抗性水平较高的菌株主要出现在和县、砀山等蔬菜基地。抗性菌株的产生可能与甲霜灵的使用频率和剂量有关，这些地方已连续多年使用，长期多次使用能增加病原菌对药剂的选择压力。从而加速抗性的产生。
目前，在尚无理想的抗病品种的情况下，用药防治仍是控制植物病害的主要措施，但抗药性问题已成为生产上的一个突出问题。在抗药性大面积产生前进行抗药性风险评估对指导防治具有重要作用。通常，评价植物病原菌对一个杀菌剂的抗药性风险主要是通过实验室和田间的诱变或筛选获得抗药菌株，再对抗药菌株进行抗药水平、抗药菌株获得的难易程度及抗药突变频率、抗药性治理的难易等进行综合评价。本研究表明，虽然敏感菌株依然是安徽省辣椒疫霉菌的优势种群。但已有36.8％的田间菌株对甲霜灵产生了抗性，抗性倍数最高超过100倍：同时，本试验证明。在室内用药剂直接诱变，能较易地获得抗甲霜灵突变株，且抗性菌株对甲霜灵的抗性可高达其敏感亲本的近1000倍，表明甲霜灵等苯基酰胺类杀菌剂的使用存在一定的抗药风险。
目前防治辣椒疫病的内吸性杀菌剂主要有苯基酰胺类(甲霜灵、恶霜灵、甲呋酰胺、苯霜灵等)、吗啉类(烯酰吗啉、氟吗啉等)、氨基甲酸酯类(霜霉威等)、烷基磷酸盐类(乙磷铝等)及乙酰胺类(霜脲氰等)等杀菌剂。由于甲霜灵在内吸性、生物活性和持效期等方面均优于其他苯基酰胺类杀菌剂。因此，作为防治辣椒疫病的有效药剂之一，弃之不用是不现实的，关键是如何降低抗药性风险、延长其使用年限。有报道表明，甲霜灵等苯基酰胺类杀菌剂间具有交互抗性。霜脲氰与苯基酰胺类间有负交互抗性㈣，但烯酰吗啉、乙磷铝、霜脲氰等与苯基酰胺类无交互抗性。根据安徽省辣椒疫霉菌对甲霜灵的抗性水平及分布情况，笔者建议：一方面。要继续监测辣椒疫霉菌抗药性的变化。并在抗药性发生初期及时改变防治策略和用药方法。特别是有计划地用上述无交互抗性的多种药剂进行交替使用，同时要避免使用甲霜灵单剂。并尽量降低其使用频率和剂量；对抗性频率较高的地区(如和县、砀山等地)则最好暂停使用苯基酰胺类杀菌剂，以降低选择压力，最大限度地阻止抗药性发展蔓延。另一方面，要加强肥水管理，注重健身栽培，提高辣椒对疫病的抵抗能力。