【摘 要】
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肿瘤干细胞的存在被认为是肿瘤耐药和复发转移的根本原因,因此研发肿瘤干细胞的活体标记示踪技术动态监测该类细胞的存在具有重要的科学价值.实验室前期发现电压门控钙离子通道α2δ1亚基是肝细胞癌干细胞的特异表面标志物,文中研究探讨利用针对α2δ1的单克隆抗体1B50-1的单链可变域与新型荧光素酶NanoLuc形成融合蛋白1B50-1scFv-NanoLuc,在体外验证其对α2δ1阳性肝癌细胞结合的特性和荧光素酶活性.1B50-1scFv和NanoLuc序列通过重叠PCR技术扩增获得1B50-1scFv-NanoL
【机 构】
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重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆400016;北京大学临床肿瘤学院细胞生物学研究室恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室,北京 100142
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肿瘤干细胞的存在被认为是肿瘤耐药和复发转移的根本原因,因此研发肿瘤干细胞的活体标记示踪技术动态监测该类细胞的存在具有重要的科学价值.实验室前期发现电压门控钙离子通道α2δ1亚基是肝细胞癌干细胞的特异表面标志物,文中研究探讨利用针对α2δ1的单克隆抗体1B50-1的单链可变域与新型荧光素酶NanoLuc形成融合蛋白1B50-1scFv-NanoLuc,在体外验证其对α2δ1阳性肝癌细胞结合的特性和荧光素酶活性.1B50-1scFv和NanoLuc序列通过重叠PCR技术扩增获得1B50-1scFv-NanoLuc的融合片段,并在C端添加Flag标签肽(命名为1B50-1scFv-NanoLucFlag),然后采用常规DNA克隆技术将融合片段克隆到真核表达载体.利用聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)将1B50-1scFv-NanoLucFlag真核表达载体转染至悬浮型人胚肾293细胞(FreeStyle 293F).蛋白免疫印记实验证明融合蛋白在FreeStyle 293F细胞培养上清中表达,其分子量约为50 kDa.融合蛋白经ANTI-FLAG(R) M2亲和层析柱纯化后,经流式细胞仪法测定融合蛋白1B50-1scFv-NanoLucFlag对高表达α2δl的Hep-12肝癌细胞具有高亲和活性.进一步,1B50-1scFv-NanoLucFlag与高表达α2δ1的肝癌细胞结合后显示出强的荧光素酶活性.这些结果表明融合蛋白1B50-1scFv-NanoLucFlag可用于α2δ1阳性肝癌干细胞的标记并可通过荧光素酶化学发光法进行示踪.
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