目的 构建尖吻蝮蛇舌状虫若虫cDNA入门文库和表达文库,并对表达文库进行免疫学筛选.方法 从人工感染尖吻蝮蛇舌状虫虫卵的昆明小鼠中分离若虫,TRIzol试剂提取总RNA,分离纯化mRNA.利用Gateway克隆技术,通过BP重组反应,将合成的双链cDNA重组至入门载体pDONR222上,电转化至DH10B细胞,构建得到cDNA入门文库.从入门文库抽提质粒,经LR重组反应重组至表达载体pDEST17上,转化至BL21(DE3)细胞,得到cDNA表达文库.应用人工感染小鼠混合血清对表达文库进行免疫筛选,对筛选到的阳性克隆进行测序,利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)中的Finder程序分析阳性克隆序列的开放阅读框(ORF),BLAST(basic local alignment search tool)程序进行同源性分析,并将新发现的基因登录至GenBank.采用生物信息学软件对基因预测编码蛋白的理化性质、二级结构及B细胞表位进行分析.结果 cDNA入门文库的平均滴度的菌落形成单位(CFU)为1.45×105CFU/ml,库总容量为1.74 × 106 CFU,平均插入片段大小约为1.4 kb,插入片段范围为0.2～ 4.0 kb;表达文库的库总容量可达1.00×105 CFU,平均插入片段大小约为1.0 kb,插入片段范围为0.3 ～ 2.2 kb.对表达文库进行初步免疫学筛选,共获取到5个阳性克隆,测序后经同源性比对,在舌形虫物种内未发现同源性较高的基因,说明这5个基因序列均为尖吻蝮蛇舌状虫新基因,将新基因序列登录至GenBank,登录号为JQ180451 ～ JQ180455.利用生物信息学软件对5个阳性克隆的预测编码蛋白进行分析,发现它们均具有成为有价值的重组诊断抗原的潜能.结论 成功构建了尖吻蝮蛇舌状虫若虫cDNA文库,同时发现了尖吻蝮蛇舌状虫的5个新基因,cDNA文库的建立和新基因的发现为今后舌形虫基因功能的研究及免疫诊断抗原的筛选奠定了基础。
尖吻蝮蛇舌状虫若虫cDNA文库的构建和免疫筛选
【摘 要】
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目的 构建尖吻蝮蛇舌状虫若虫cDNA入门文库和表达文库,并对表达文库进行免疫学筛选.方法 从人工感染尖吻蝮蛇舌状虫虫卵的昆明小鼠中分离若虫,TRIzol试剂提取总RNA,分离纯化mRNA.利用Gateway克隆技术,通过BP重组反应,将合成的双链cDNA重组至入门载体pDONR222上,电转化至DH10B细胞,构建得到cDNA入门文库.从入门文库抽提质粒,经LR重组反应重组至表达载体pDEST17
【机 构】
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浙江省疾病预防控制中心,200025上海,中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室,世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心,200025上海,中国疾病预防控制中
【出 处】
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中华地方病学杂志
【发表日期】
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2012年31期
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