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摘要 [目的]掌握食品中沙门氏菌能力验证中可疑菌落的分离及鉴定，分析食品中沙門氏菌检验过程中存在漏检的可能性及判定方法。[方法]按照沙门氏菌能力验证作业指导书及GB 4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》的要求对编号为224号、740号、845号3份能力验证考核样品进行沙门氏菌的检测。[结果]3份样品中均检出沙门氏菌，其中224号样品中检出沙门氏菌双相亚利桑那亚种。[结论]3份能力验证样品结果均为满意。
关键词 能力验证;沙门氏菌;分离鉴定
沙门氏菌是一种无芽孢、无荚膜、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌，易存在于家禽、肉及蛋等食品中，是食品中分布比较广、危害程度严重的食源性致病微生物，可引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻及发热等疾病[1]。随着对沙门氏菌的不断深入研究，现已发现沙门氏菌超过3 000种血清型[2]。正是由于沙门氏菌具有存在广泛、种类繁多等特点，且我国每年大多数食物中毒事件都是由沙门氏菌感染引起的，所以食品中沙门氏菌的检验对强化食品安全、保障人民卫生健康具有重要意义。
食品微生物能力验证是通过按照预先制定的准则来考察评价实验室是否具备从事微生物检测能力的重要手段。因此，参加能力验证活动对实验室质量控制有着非常重要的意义[3]。目前，食品中沙门氏菌的检测有多种方法，其中比较常用的是GB4789.4的传统培养方法，此外还有酶联免疫分析法、环介导等温扩增法、普通PCR法、实时荧光定量PCR法、序列分析及生物飞行质谱法等[4]。笔者比较了沙门氏菌能力验证作业指导书及GB 4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》对食品中沙门氏菌能力验证的结果，为食品中沙门氏菌的能力验证提供一些参考依据。
1材料与方法
1.1标准菌株
沙门氏菌能力验证采用的标准菌株为鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）和大肠埃希氏菌（ATCC 25922）。
1.2试剂与仪器
缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫酸钠黄绿增菌液（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸增菌（SC）、亚硫酸铋琼脂（BS）、三糖铁（TSI）、营养琼脂均使用北京陆桥技术股份有限公司产品;沙门显色培养基使用法国科玛嘉产品，沙门氏菌属诊断O及H血清使用宁波天润生物药业有限公司产品，VIDAS SLM试剂条及VITEK 2 GN鉴定卡使用法国生物梅里埃产品，所有试剂均为笔者所在实验室合格供应方提供并在有效期内。
移液器Eppendorf research plus（德国Eppendorf公司）、MSC1.8型生物安全柜（赛默飞世尔科技有限公司）、 恒温培养箱（德国宾得）、5050型全自动高压蒸汽灭菌锅（以色列腾氏公司）、全自动荧光免疫分析仪VIDAS（法国生物梅里埃）及全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK 2（法国生物梅里埃）。
1.3检测方法
检验方法主要依据沙门氏菌检验作业指导书以及GB 4789.4-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验》的要求进行。
2结果与分析
2.1酶联免疫分析技术检验结果
分别将224号、740号、845号3份样品按照作业指导书的要求接种于BPW后置于36℃恒温培养箱中培养，分别取培养10、14和18 h后的增菌液接种于TTB和SC进行选择性增菌，每份样品各接种3管（其中预增菌10 h样品仅检测1管），分别按要求放置于36℃（SC）和42℃（TTB）恒温培养箱中继续培养24 h后使用全自动荧光免疫分析仪VIDAS进行检测（检测值<0.23为阴性，≥0.23为阳性）。
由表1～3可知，740号、845号2份样品3个重复在经TTB和SC选择性增菌10、14、18 h后结果均为阳性，而224号样品仅有1个重复在经SC增菌14 h后为阳性，其余结果均为阴性，造成这种现象可能是由于224号样品中含有的多种干扰菌生长旺盛，从而抑制了沙门氏菌的正常生长，导致沙门氏菌的含量低于仪器检出限。此外试验结果表明740号和845号样品经TTB增菌后18 h的检测值要高于14 h的检测值，经SC增菌后18 h的检测值要低于14 h的检测值，表明TTB相对SC而言对样品中非沙门氏菌具有一定的抑制性。
2.2常规微生物培养法检验结果
分别将接种于TTB和SC的增菌液用接种环转接至BS琼脂和沙门显色培养基后，置于36℃恒温培养箱中培养24～48 h后观察结果（图1），从每块平板上至少挑取3个可疑菌落接种于TSI琼脂，同时接种到营养琼脂上进行纯化并置于36℃恒温培养箱中培养24 h，最后将纯化后的菌落用全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK 2进行鉴定。可疑菌落经VITEK 2鉴定后显示740号、845号样品结果均为沙门氏菌属（Salmonella group），224号样品鉴定结果为沙门氏菌亚利桑那亚种（Salmonella enterica ssp. Diarizonae）。
2.3血清凝集试验结果
样品分离菌的血清学分型结果见表4。结果显示，740号和845号2份考核样品O抗原A-F多价血清和H多价血清均可正常凝集，224号样品O抗原A-F多价血清不能正常凝集，经过0抗原因子逐一筛查发现O60单因子血清可以凝集，H多价血清在经过诱导后可以产生正常凝集反应。
3结论与讨论
结合以上生化试验和血清学鉴定结果得出，3个样品均检测出沙门氏菌，其中224号样品为沙门氏菌双相亚利桑那亚种，此次能力验证结论最终为满意结果。
目前，国标中要求做食品中沙门氏菌检验增菌环节中必须使用TTB和SC 2种增菌液同时进行增菌，在选择性分离环节中必须同时使用BS琼脂平板和XLD（或HE、沙门显色平板）进行分离。这是由于沙门氏菌具有3 000多种血清型，部分沙门氏菌具有比较特殊的生理生化特性，仅使用1种培养基有很大可能造成漏检;同时有的沙门氏菌在选择性增菌液中，生长会受到一定的抑制，同时使用2种增菌液会提高检出率。
此次能力验证740号和845号样品在VIDAS上可以得出准确的初筛结果，同时在BS琼脂平板和沙门显色平板上均能出现典型可疑菌落;224号样品在使用VIDAS进行初筛时仅有1管提示为阳性，这可能是由于样品中含有大量干扰菌造成沙门氏菌双相亚利桑那亚种在增菌过程中生长受到抑制，导致该样品中沙门氏菌的含量低于仪器检出限;此外该样品在沙门显色平板上菌落为蓝色菌落，不是标准的紫红色菌落，以上2种情况会造成对该样品的误判，导致沙门氏菌的漏检。因此在检测沙门氏菌时除对典型菌落进行鉴定外，还必须挑去一些平板上的非典型菌落进行筛查，从而避免漏检情况的发生。
740号和845号样品在血清凝集试验中O多价血清和H多价血清均可凝集，但是224号样品O抗原A-F多价血清不凝集，由于VITEK 2提示该样品中含有沙门氏菌双相亚利桑那亚种，继而使用O抗血清单因子对该纯化菌落进行逐一筛查，最终发现使用O60单因子血清可以获得凝集反应，这些非典型的特征都会造成该样品中沙门氏菌的漏检。通过此次沙门氏菌能力验证发现个别沙门氏菌仅依靠常规经验对典型可疑菌落进行判断是不够的，在试验中还必须尽可能多地挑取非典型特征的菌落进行生化鉴定，同时结合VITEK 2生化鉴定系统进行判断。
参考文献
[1] 彭易根，张正群.亚利桑那沙门氏菌食物中毒72例临床分析[J].现代医药卫生，2011，27（4）：571-572.
[2] GUIBOURDENCHE M，ROGGENTIN P，MIKOLEIT M，et al. Supplement 2003-2007 （No.47） to the White？鄄Kauffmann？鄄Le Minor scheme [J]. Research in Microbiology， 2010，
161（1）：26-29.
[3] 骆海朋，唐颂，陈怡文，等.沙门氏菌能力验证样品的研制及其应用[J].食品安全质量检测学报，2016，7（4）：1473-1478.
[4] 罗荣，任秀，崔生辉. 食品中沙门氏菌快速检测技术研究进展[J].食品安全质量检测学报，2016，7（4）：1468-1472.
责任编辑：郑丹丹
关键词 能力验证;沙门氏菌;分离鉴定
沙门氏菌是一种无芽孢、无荚膜、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌，易存在于家禽、肉及蛋等食品中，是食品中分布比较广、危害程度严重的食源性致病微生物，可引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻及发热等疾病[1]。随着对沙门氏菌的不断深入研究，现已发现沙门氏菌超过3 000种血清型[2]。正是由于沙门氏菌具有存在广泛、种类繁多等特点，且我国每年大多数食物中毒事件都是由沙门氏菌感染引起的，所以食品中沙门氏菌的检验对强化食品安全、保障人民卫生健康具有重要意义。
食品微生物能力验证是通过按照预先制定的准则来考察评价实验室是否具备从事微生物检测能力的重要手段。因此，参加能力验证活动对实验室质量控制有着非常重要的意义[3]。目前，食品中沙门氏菌的检测有多种方法，其中比较常用的是GB4789.4的传统培养方法，此外还有酶联免疫分析法、环介导等温扩增法、普通PCR法、实时荧光定量PCR法、序列分析及生物飞行质谱法等[4]。笔者比较了沙门氏菌能力验证作业指导书及GB 4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》对食品中沙门氏菌能力验证的结果，为食品中沙门氏菌的能力验证提供一些参考依据。
1材料与方法
1.1标准菌株
沙门氏菌能力验证采用的标准菌株为鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）和大肠埃希氏菌（ATCC 25922）。
1.2试剂与仪器
缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫酸钠黄绿增菌液（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸增菌（SC）、亚硫酸铋琼脂（BS）、三糖铁（TSI）、营养琼脂均使用北京陆桥技术股份有限公司产品;沙门显色培养基使用法国科玛嘉产品，沙门氏菌属诊断O及H血清使用宁波天润生物药业有限公司产品，VIDAS SLM试剂条及VITEK 2 GN鉴定卡使用法国生物梅里埃产品，所有试剂均为笔者所在实验室合格供应方提供并在有效期内。
移液器Eppendorf research plus（德国Eppendorf公司）、MSC1.8型生物安全柜（赛默飞世尔科技有限公司）、 恒温培养箱（德国宾得）、5050型全自动高压蒸汽灭菌锅（以色列腾氏公司）、全自动荧光免疫分析仪VIDAS（法国生物梅里埃）及全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK 2（法国生物梅里埃）。
1.3检测方法
检验方法主要依据沙门氏菌检验作业指导书以及GB 4789.4-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验》的要求进行。
2结果与分析
2.1酶联免疫分析技术检验结果
分别将224号、740号、845号3份样品按照作业指导书的要求接种于BPW后置于36℃恒温培养箱中培养，分别取培养10、14和18 h后的增菌液接种于TTB和SC进行选择性增菌，每份样品各接种3管（其中预增菌10 h样品仅检测1管），分别按要求放置于36℃（SC）和42℃（TTB）恒温培养箱中继续培养24 h后使用全自动荧光免疫分析仪VIDAS进行检测（检测值<0.23为阴性，≥0.23为阳性）。
由表1～3可知，740号、845号2份样品3个重复在经TTB和SC选择性增菌10、14、18 h后结果均为阳性，而224号样品仅有1个重复在经SC增菌14 h后为阳性，其余结果均为阴性，造成这种现象可能是由于224号样品中含有的多种干扰菌生长旺盛，从而抑制了沙门氏菌的正常生长，导致沙门氏菌的含量低于仪器检出限。此外试验结果表明740号和845号样品经TTB增菌后18 h的检测值要高于14 h的检测值，经SC增菌后18 h的检测值要低于14 h的检测值，表明TTB相对SC而言对样品中非沙门氏菌具有一定的抑制性。
2.2常规微生物培养法检验结果
分别将接种于TTB和SC的增菌液用接种环转接至BS琼脂和沙门显色培养基后，置于36℃恒温培养箱中培养24～48 h后观察结果（图1），从每块平板上至少挑取3个可疑菌落接种于TSI琼脂，同时接种到营养琼脂上进行纯化并置于36℃恒温培养箱中培养24 h，最后将纯化后的菌落用全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK 2进行鉴定。可疑菌落经VITEK 2鉴定后显示740号、845号样品结果均为沙门氏菌属（Salmonella group），224号样品鉴定结果为沙门氏菌亚利桑那亚种（Salmonella enterica ssp. Diarizonae）。
2.3血清凝集试验结果
样品分离菌的血清学分型结果见表4。结果显示，740号和845号2份考核样品O抗原A-F多价血清和H多价血清均可正常凝集，224号样品O抗原A-F多价血清不能正常凝集，经过0抗原因子逐一筛查发现O60单因子血清可以凝集，H多价血清在经过诱导后可以产生正常凝集反应。
3结论与讨论
结合以上生化试验和血清学鉴定结果得出，3个样品均检测出沙门氏菌，其中224号样品为沙门氏菌双相亚利桑那亚种，此次能力验证结论最终为满意结果。
目前，国标中要求做食品中沙门氏菌检验增菌环节中必须使用TTB和SC 2种增菌液同时进行增菌，在选择性分离环节中必须同时使用BS琼脂平板和XLD（或HE、沙门显色平板）进行分离。这是由于沙门氏菌具有3 000多种血清型，部分沙门氏菌具有比较特殊的生理生化特性，仅使用1种培养基有很大可能造成漏检;同时有的沙门氏菌在选择性增菌液中，生长会受到一定的抑制，同时使用2种增菌液会提高检出率。
此次能力验证740号和845号样品在VIDAS上可以得出准确的初筛结果，同时在BS琼脂平板和沙门显色平板上均能出现典型可疑菌落;224号样品在使用VIDAS进行初筛时仅有1管提示为阳性，这可能是由于样品中含有大量干扰菌造成沙门氏菌双相亚利桑那亚种在增菌过程中生长受到抑制，导致该样品中沙门氏菌的含量低于仪器检出限;此外该样品在沙门显色平板上菌落为蓝色菌落，不是标准的紫红色菌落，以上2种情况会造成对该样品的误判，导致沙门氏菌的漏检。因此在检测沙门氏菌时除对典型菌落进行鉴定外，还必须挑去一些平板上的非典型菌落进行筛查，从而避免漏检情况的发生。
740号和845号样品在血清凝集试验中O多价血清和H多价血清均可凝集，但是224号样品O抗原A-F多价血清不凝集，由于VITEK 2提示该样品中含有沙门氏菌双相亚利桑那亚种，继而使用O抗血清单因子对该纯化菌落进行逐一筛查，最终发现使用O60单因子血清可以获得凝集反应，这些非典型的特征都会造成该样品中沙门氏菌的漏检。通过此次沙门氏菌能力验证发现个别沙门氏菌仅依靠常规经验对典型可疑菌落进行判断是不够的，在试验中还必须尽可能多地挑取非典型特征的菌落进行生化鉴定，同时结合VITEK 2生化鉴定系统进行判断。
参考文献
[1] 彭易根，张正群.亚利桑那沙门氏菌食物中毒72例临床分析[J].现代医药卫生，2011，27（4）：571-572.
[2] GUIBOURDENCHE M，ROGGENTIN P，MIKOLEIT M，et al. Supplement 2003-2007 （No.47） to the White？鄄Kauffmann？鄄Le Minor scheme [J]. Research in Microbiology， 2010，
161（1）：26-29.
[3] 骆海朋，唐颂，陈怡文，等.沙门氏菌能力验证样品的研制及其应用[J].食品安全质量检测学报，2016，7（4）：1473-1478.
[4] 罗荣，任秀，崔生辉. 食品中沙门氏菌快速检测技术研究进展[J].食品安全质量检测学报，2016，7（4）：1468-1472.
责任编辑：郑丹丹