云南省石榴干腐病病菌生物学特性研究及其防治药剂筛选

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  摘要:以石榴干腐病病菌SGF1为供试菌株,采用菌丝生长速率法测定不同培养基、碳源、氮源、温度、酸碱度、光照和湿度对其菌丝生长的影响,用血球计数板计测产孢量,并在室内筛选有效抑菌药剂。结果表明,该病原菌菌丝生长最佳培养条件为PDA培养基、以可溶性淀粉为碳源、蛋白胨为氮源、28 ℃、pH值为7、全光照、相对湿度60%。BA培养基、28 ℃、pH值8最适合产孢。58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂和50%扑海因可湿性粉剂3种药剂抑菌效果最好,抑制率达100%。研究结果为云南石榴干腐病的防治提供了一定的理论依据。
  关键词:石榴;干腐病;生物学特性;药剂筛选
  中图分类号: S436.65 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2017)01-0099-04
  石榴(Punia granatum)是滇南主要水果之一。云南省蒙自市由于北回归线穿境而过,独特的气候条件适宜石榴种植,曾获“中国石榴之乡”的美誉。目前蒙自市石榴栽种面积跃居全国首位,然而随着栽种面积不断扩大,石榴受到各种真菌病害的危害,严重影响其品质和产量。蒙自市石榴干腐病在1979年,戴芳澜先生的《中国真菌总汇》中早有记载[1]。1999年,周又生等研究蒙自市石榴干腐病发生规律及其防治,使蒙自市石榴干腐病得到有效控制[2]。2011年,蒙自市石榴干腐病再次暴发流行。据文献记载蒙自市石榴干腐病由石榴鲜壳孢(Zythia versoniana)引起[1,3],而陕西省报道的石榴干腐病由石榴垫壳孢菌(Coniella granati)引起[4]。由此可见,不同地区石榴干腐病病菌种属分类地位不同,其生物学特性也会存在差异。周又生等研究蒙自市石榴干腐病病菌生物学特性,仅限于温度、湿度和pH值3个方面[2],未对其碳源、氮源、光照等方面进行系统研究,防治化学药剂也仅限于百菌清、甲基硫菌灵、代森锌和波尔多液。鉴于此,笔者对蒙自市石榴干腐病病菌生物学特性及其抑菌剂做系统研究,以期为有效防控该病提供系统理论依据。
  1 材料与方法
  1.1 供试菌株
  从云南省蒙自市石榴种植基地采集症状典型的石榴干腐病病果,采用常规组织分离和单孢分离法进行分离纯化,获得的菌株(SGF1)于斜面培养基上低温(4 ℃)保存。
  1.2 供试培养基
  PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基):马铃薯200 g、葡萄糖16 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L;PSA(马铃薯蔗糖琼脂培养基):马铃薯200 g、蔗糖16 g、琼脂粉 20 g、蒸馏水1 L;MA(玉米琼指培养基):玉米30 g、琼脂粉17 g、蒸馏水1 L;WA(燕麦琼脂培养基):小麦30 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L;CA(胡萝卜琼脂培养基):胡萝卜200 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L;CM(查氏培养基):硝酸钠2.00 g、磷酸二氢钾1.00 g、氯化钾0.50 g、七水硫酸镁0.50 g、硫酸铁0.01 g、蔗糖30.00 g、琼脂粉 20 g、蒸馏水1 L;BA(大豆葡萄糖琼脂培养基):大豆200 g、葡萄糖16 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L;WJA(万寿菊葡萄糖琼脂培养基):万寿菊植株200 g、葡萄糖16 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L。上述培养基配制好后均121 ℃高压灭菌25 min。
  1.3 试剂
  碳源(可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇)、氮源(硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素)。0.1% HCl、0.1% NaOH溶液,试剂均为分析纯。
  1.4 供试杀菌剂
  甲霜灵·锰锌、多菌灵、甲基硫菌灵、百菌清、扑海因、春雷霉素。上述材料均购自农贸市场及试剂公司。
  1.5 不同培养基对菌丝生长的影响
  将石榴干腐病病菌在PDA平板培养基中,28 ℃扩大培养7 d,在培养基同一半径周围用打孔器取直径为5 mm的菌块,同时接种于PDA、PSA、CM、MA、WA、CA、BA和WJA 8种培养基平板中央,设3次重复,在25 ℃下恒温培养7 d,十字交叉法测定菌落直径,用血球计数板计数产孢量[5]。
  1.6 不同碳、氮源对菌丝生长的影响
  以查氏培养基为基础培养基,分别用相等质量分数的碳源(可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇)和氮源(硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素)替换蔗糖和硝酸钠,设不加碳源、氮源为对照。接种及测量方法同“1.5”节。
  1.7 不同温度对菌丝生长的影响
  以PDA为供试培养基,接种后分别在10、15、20、25、30、35、40 ℃下恒温培养[5],接种及测量方法同“1.5”节。
  1.8 不同pH值对菌丝生长的影响
  以PDA为供试培养基,分别用0.1% HCl及0.1%NaOH溶液将pH值调至3、4、5、6、7、8、9、10[5],接种及测量方法同“1.5”节。
  1.9 光照对菌丝生长的影响
  以PDA为供试培养基,接种后分別在光—暗周期为 12 h—12 h、全黑暗和全光照3种光处理下培养[5],接种及测量方法同“1.5”节。
  1.10 不同湿度对菌丝生长的影响
  将病菌接种于PDA培养基平板中央,分别在相对湿度为50%、60%、70%、80%、90%、100%的培养箱中培养7 d[5],测量方法同“1.5”节。
  1.11 药敏性测定
  将58%甲霜灵·锰锌、50%多菌灵、70%甲基硫菌灵、75%百菌清、50%扑海因、6%春雷霉素6种可湿性粉剂杀菌剂按照使用说明上的浓度配成PDA含药营养液后倒平板,将石榴干腐病病菌菌块接种于平板中央,设不加药液的PDA平板为对照,培养7 d后,测量菌落直径,并计算6种药剂对菌落生长的抑制率[5],接种及测量方法同上。   抑制率=[(dCK-dB)/dCK]×100%。
  式中:dCK表示对照病原菌菌落直径,dB表示处理病原菌菌落直径。
  1.12 数据分析
  所有试验数据均采用SPSS 19.0统计软件Duncans多重比较法进行统计分析,计算处理间的差异显著性。
  2 结果与分析
  2.1 不同培养基对菌丝生长及其产孢的影响
  由表1可知,供试菌株SGF1均能在8种不同培养基上生长,具有较强的营养适应性,说明供试菌株对营养条件的要求并不是很严格,但对8种培养基的利用效果有所差异。经Duncans多重比较发现,供试菌株在8种不同培养基上的菌落直径差异极显著,其中,在PDA培养基上生长最快,在CM培养基上生长最慢。在其余6种培养基上的生长强弱顺序为PSA>WJA>WA>CA>BA>MA。另外,在8种培养基中,病菌SGF1产孢量差异极显著,其中,在BA培养基中产孢最多,在CM上不产孢。因此,最适合该病菌菌丝生长的培养基为PDA,最适合产孢的培养基为BA。
  2.2 不同碳源对菌丝生长的影响
  由表2可知,除在D-甘露醇和无碳源对照中不能生长之外,供试菌株SGF1在其余6种不同碳源培养基上均能生长,经Duncan’s多重比较发现,麦芽糖和葡萄糖中菌落直径差异不显著,但与其余碳源差异极显著。α-乳糖、鼠李糖和木糖醇3个处理间的菌落直径差异极显著,菌落直径大小顺序为α-乳糖>鼠李糖>木糖醇。可溶性淀粉中菌落直径与其余所有供试碳源差异极显著,且菌落直径最大。说明可溶性淀粉最有利于其菌丝生长。
  2.3 不同氮源对菌丝生长的影响
  由表3可知,供试菌株SGF1在8种氮源培养基上均能生长。但其对氮源的利用效果不同。经Duncan’s多重比较发现,蛋白胨中菌落直径与其余氮源差异极显著,且菌落直径最大。其中,硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸和尿素中菌落直径小于对照,表明这4种氮源对其有抑制作用。其余4种氮源对供试菌株生长有促进作用,蛋白胨最有利于其菌丝生长。
  2.4 不同温度对菌丝生长及产孢的影响
  由表4可知,供试菌株SGF1在10~35 ℃范围内均能生长。经Duncans多重比较发现,各温度处理间的菌落直径差异极显著。在10~28 ℃范围内,温度越高菌落直径越大,28 ℃ 时菌落直径达到最大值,30 ℃和35 ℃时菌落直径小于28 ℃时,40 ℃时菌落直径为0.00 mm。另外,28 ℃时产孢量与其余温度差异极显著,且产孢量最大。25 ℃和30 ℃时差异极显著,产孢量均小于28 ℃时。其余温度下产孢量均为0,说明28 ℃是供试菌株菌丝生长及产孢的最佳温度。
  2.5 不同pH值对菌丝生长及产孢的影响
  由表5可知,供试菌株SGF1在pH值3~10范围内均能生长。经Duncans多重比较发现,pH值为7时与其余处理间菌落直径差异极显著,且菌落直径最大,说明pH值7为菌丝生长最佳酸碱度值。pH值6、pH值8、pH值9,3个处理间菌落直径差异均不显著,pH值3和pH值4这2个处理间菌落直径差异不显著,其余处理间菌落直径差异极显著。pH值8产孢量与其余处理差异极显著,且产孢量最大。因此,中性偏碱环境有利于供试菌株菌丝生长及产孢。
  2.6 不同光照对菌丝生长的影响
  由表6可知,供试菌株SGF1在3种不同光照条件下均能生长。经Duncans多重比较发现,3种处理间菌落直径差异极显著,且全光照菌落直径最大,光暗交替菌落直径最小,全黑暗居中。说明全光照最有利于其生长。
  2.7 不同湿度对菌丝生长的影响
  由表7可知,供试菌株SGF1在相对湿度50%~100%范围内均能生长。经Duncans多重比较发现,相对湿度60%与其余处理间菌落直径差异极显著,且菌落直径最大。说明供试菌株最适合的湿度为60%。超出此范围,病菌的生长受到抑制。
  2.8 石榴干腐病菌药敏性试验
  由表8、图1可知,6种药剂对供试菌株SGF1的抑制作用不同。经Duncans多重比较发现,在58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂和50%扑海因可湿性粉剂的培养基中菌落直径差异不显著,但与其余处理间差异极显著,病菌均不能生长,抑制率达到100%。50%多菌灵可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂和6%春雷霉素3种药剂之间菌落直径差异极显著,抑制率在25%~55%之间。说明抑菌效果最好的药剂为58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂和50%扑海因可湿性粉剂。
  3 结论与讨论
  对石榴干腐病病菌SGF1菌株生物学特性的研究表明,最适培养基为PDA培养基、最佳碳源为可溶性淀粉、氮源为蛋白胨、最适温度为28 ℃、最佳酸碱度为pH值7、全光照、最适相对湿度为60%。其对温度和pH值的要求与周又生等[2]、宁豫婷等[6]、孙德茂[7]的研究结果一致。湿度的研究结果与孙德茂的结论[7]不一致,原因是蒙自市和陕西省2地石榴干腐病病菌種属分类地位不同。石榴干腐病属于世界性病害,中国山西[8]、山东[9]、陕西[4]、河南[10]、安徽[11]、贵州[12]、云南[2]等省份均有报道。其中,河南[6,10,13]、贵州[11]、云南[2]的石榴干腐病病菌为石榴鲜壳孢,陕西省报道的石榴干腐病病菌为石榴垫壳孢菌[4]。希腊[14]和韩国[15]的石榴干腐病病菌与中国陕西省的一致。中国其他省份的石榴干腐病病菌尚未见系统鉴定,对其生物学特性也未见系统研究报道。笔者研究发现,光照对病菌生长有影响,可溶性淀粉为最佳碳源,蛋白胨为最佳氮源,硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸和尿素4种氮源对其病菌有抑制作用,磷酸二氢铵对其病菌生长有促进作用。因此,在石榴上施用氮肥可选择硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸和尿素,避免施用磷酸二氢铵。   另外,在室内药剂筛选方面,甲霜灵·锰锌、百菌清和扑海因3种药剂对SGF1菌株抑制效果最好,抑制率均达100%,其他3种药剂抑菌效果不理想,抑制率均小于60%。这与孙德茂[7]、汤玉等[10]、周又生等[2]、孙国山[16]的研究结果不尽相同。百菌清防治效果好,这一结论与周又生等的研究结论[2]一致,多菌灵防效与左振琴等的研究结果[13]不一致。说明不同地区使用的有效药剂不尽相同。有必要对当地发生的石榴干腐病进行药剂筛选。蒙自地区石榴干腐病可选用甲霜灵·锰锌、百菌清和扑海因防治。
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