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【中图分类号】R-332 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455(2010)08-0148-02
黄精(polygonatum sibiricum Red) 又名老虎姜、太阳草、鸡头参,是百合科黄精属多年生草本植物的干燥根茎,始载于《名医别录》,李时珍引《神仙草芝经》云:“黄精宽中益气,使五脏调和,肌肉充盈,骨髓坚强,其力倍增,多年不老,颜色显明,发白更黑,齿落更生”。黄精是一种传统名贵中药,具有宽中益气,益肾填精,滋阴润肺,生津补脾,安五脏,填精髓等功效,在抗菌、解毒、抗疲劳、抗衰老等方面均有较好的效果[1]。其化学成分主要有:黄精多糖、甾体皂苷、蒽醌类化合物、生物碱、强心苷、维生素和多种对人体有用的氨基酸等化合物[2],其中黄精多糖(polygonatum sibiricum poly Saccharides)是黄精化学组成的一个重要组成部分,也是黄精主要生物学活性成分之一。
1 材料与方法
1.1 实验动物:昆明种雄性小鼠,6～8周龄,体重18～22g,购自中南大学湘雅医学院(许可证号:SCXK湘2007-2008),饲养于室内通风柜,每天正常供食及饮水。
将小鼠随机分为4组,每组20只,组间体重经t检验无显著差异。对照组、低剂量、中剂量组和高剂量组,饲养受试物量分别为:0.0、400mg/kg、800mg/kg和1200mg/kg的黄精多糖,对照组给同体积的蒸馏水。每10g体重给予受试物0.2mL,采取灌胃法,连续给予受试物28d后,测定各指标。
1.2 药品与仪器试剂
1.2.1 受试物黄精多糖的提取分离与精制[4]:取干燥的黄精根茎,打碎过15目筛网,称取粉末100g,用石油醚于80～90℃下回流脱去黄精粉末中的脂肪,直至石油醚溶剂滴在滤纸上不出现油痕为止。蒸干溶剂后,药渣用80%的乙醇浸渍过夜,于80～90℃回流提取两次,过滤,将药渣用500mL蒸馏水90℃浸提1h,再用等量蒸馏水重复浸提30min,过滤后合并滤液, 减压浓缩至150mL。用氯仿-正丁醇萃取多次,除去浓缩液中的蛋白质,并用1%的活性炭脱色2次,抽滤后的滤液加入95%乙醇使含醇量达80%,静置过夜后过滤,所得滤饼依次用95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤4次,真空干燥,得精制的黄精多糖。
1.2.2 试剂:谷氨酸和γ-氨基丁酸(Sigma公司);丹酰氯(Fluka公司);尿素氮测定试剂盒(北京化工厂)。其他试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水。
1.2.3 仪器:LC-2010岛津高效液相色谱仪(日本);YC-30超速离心机(北京安必升科技发展有限公司);752W分光光度计(上海精科实业有限公司),FA-1004分析天平(上海精科实业有限公司);游泳箱(120cm X 70cm X 80cm,自制)。
1.3 小鼠体力性疲劳模型的建立与试验方法
1.3.1 游泳试验[5]:连续给药28d,末次给予受试物30min后,在大鼠尾根部负以小鼠体重5%的铅丝,放入水温(25±0.5)℃,水深40cm的游泳箱中,用秒表记录自游泳开始至力竭(小鼠沉没后10S仍不能浮出水面)的时间作为小鼠力竭性游泳时间。
1.3.2 爬杆试验[5]:连续给药28d,末次给予受试物30min后,将小鼠放在爬杆架的有机玻璃棒上,使其肌肉处于紧张状态,记录小鼠由于肌肉疲劳从有机玻璃上跌落下来的时间。第三次跌落时终止实验,累计三次的时间作为爬杆时间。
1.4 血尿素的测定:连续给药28d,末次给予受试物30min后,将小鼠放于水温25± 1℃的游泳箱中游泳90min,休息60min后摘眼球取血,取血清用试剂盒(二乙酰一肟法)测定[6]。
1.5 血乳酸的测定:连续给药28d,末次给予受试物30min后,将小鼠放于水温30±1℃的水中负重5%游泳10min停止,分别从游泳前、游泳之后0、15、60min的小鼠眼内眦静脉丛取血。于5ml离心管中加入1% NaF溶液0.48ml,准确吸取全血20μL加入试管底部。用试管上清液冲洗微量吸管数次,再加入蛋白沉淀剂1.5ml,振荡混匀,3000r·min-1离心10min,取上清液测定。
1.6 肝糖原的测定:连续给药28d,末次给予受试物30min后,将小鼠放于水温30±1℃的水中游泳60min后停止,立即处死小鼠取出肝脏,精确称取200mg,加入TCA4ml,每管匀浆1min,3000r·min-1离心15min,取上清液转移至另一试管内。在沉淀中加入TCA4ml。匀浆1min,再次离心15min,取上清液,与第一次离心的上清液合并,充分混匀。取1ml上清液,每管加入95%的乙醇4ml,充分混匀至两种液体间不留有界面。室温放置过夜。沉淀完全后将试管于3000r·min-1离心15min。小心倒掉上清液并使试管放置10min,用1ml蒸馏水振荡溶解后测定[6]。
1.7 肌糖原的测定:连续给药28d,末次给予受试物30min后,将小鼠放于水温30±1℃的水中游泳60min后停止,立即处死小鼠取出肌肉,以0.9%NaCI溶液冲洗后,用滤纸吸干,准确称取肌肉1g,放入盛有3mL30%KOH的试管中,置沸水浴煮20min,取出冷却后,将其转移至50ml容量瓶中,用水多次洗涤试管,一并转入容量瓶,加水稀至刻度,摇匀待用。置沸水浴中10min,冷卻后在620nm波长处测量光吸收值,同时空白对照。
1.8 小鼠脑内GLu和GABA含量的HPLC测定:脑组织加蒸馏水后超声匀浆加入高氯酸,25000r·min-1离心15min,4℃取上清液,滴加KHCO3,调至pH9.8。加入丹酰氯/丙酮,加热反应40min后,滴加HCI终止反应,30000 r·min-1离心10min,取上清液进行HPLC测定。
1.9 数据统计学处理:用SPSS11.5统计软件对测量得到的数据进行处理,以 表示。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果与分析
2.1 黄精多糖对小鼠游泳时间、爬杆时间、血清尿素氮、肝糖原和肌糖原含量的影响:将实验组与对照组的实验结果相对比,高剂量组游泳时间提高了54%(P<0.01),中剂量组游泳时间提高了32%(P<0.05)。实验组与对照组相比,低剂量组爬杆时间提高了123%(P<0.001), 中剂量组爬杆时间提高了135%(p<0.001),高剂量组爬杆时间提高了294%(p<0.001)。实验组与对照组相比,高剂量组尿素氮含量降低了17%(p<0.01), 中剂量组降低了14%(p<0.05)。中剂量组肝糖原含量为对照组的2.5倍(p<0.01),高剂量组肝糖原含量为对照组的3.7倍(p<0001),见表1。实验组与对照组相比,爬杆时间和游泳时间显著提高;血清尿素氮明显降低;肝糖原含量显著性提高,表明黄精多糖具有延缓疲劳出现的作用。
2.2 黄精多糖对小鼠血乳酸含量的影响:高剂量组游泳后0min和15min实验组与对照组相比,血乳酸含量分别降低了25%(p<0.01)和25%(p<0.05),并且趋于游泳前的乳酸含量,见表2。运动后15min内血乳酸含量分别降低并趋于正常对照组,说明黄精多糖具有促进体力性疲劳消除的积极作用。
3 讨论
糖是机体最重要的能源物质,其中肌糖原是骨骼肌中可以随时动用的贮备能源,其贮备量与运动的耐力呈正相关;肝糖原的主要作用是维持血糖的相对稳定,随着运动时间的延长,血糖水平开始下降,为了补偿血糖的消耗,肝糖原分解和糖异生作用增强,一旦肝糖原耗竭,会使运动肌供能不足,导致外周疲劳。本实验结果表明黄精的抗疲劳作用可能与增加肝糖原、肌糖原的储备有关。当机体长时间不能通过糖、脂肪分解代谢得到足够能量时,机体蛋白质与氨基酸分解代谢随之增强,产生大量的尿素氮。机体血尿素氮含量随运动负荷增加而增加, 而且机体对负荷的适应性越差,产生的尿素氮越多。表明黄精可能通过抑制血清尿素氮的产生起到抗疲劳的作用。
以上实验数据表明,黄精多糖具有调整体内代谢和快速加强体质恢复,消除疲劳的作用。
参考文献
[1] 刘柳,郑芸,董群,方积年.黄精中的多糖组分及其免疫活性[J].中草药,2006,8:1132-1134
[2] 庞玉新,赵致,袁媛,付明学等.黄精的化学成分及药理作用[J].山地农业生物学报,2003,22(6):547～550
[3] 张庭廷,夏晓凯,陈传平等.黄精多糖的生物活性研究[J].中国实验方剂学杂志,2006,12(7):42-44
[4] 侯双菊, 林超群, 鲁坚,方红美等.黄精多糖提取工艺的试验研究[J].安徽化工,2006,4:20-22
[5] 江振友,刘弱,李久香等.复方中药抗疲劳作用的实验研究[J].中华实用中西医杂志,2006,19(18):2214-2215
黄精(polygonatum sibiricum Red) 又名老虎姜、太阳草、鸡头参,是百合科黄精属多年生草本植物的干燥根茎,始载于《名医别录》,李时珍引《神仙草芝经》云:“黄精宽中益气,使五脏调和,肌肉充盈,骨髓坚强,其力倍增,多年不老,颜色显明,发白更黑,齿落更生”。黄精是一种传统名贵中药,具有宽中益气,益肾填精,滋阴润肺,生津补脾,安五脏,填精髓等功效,在抗菌、解毒、抗疲劳、抗衰老等方面均有较好的效果[1]。其化学成分主要有:黄精多糖、甾体皂苷、蒽醌类化合物、生物碱、强心苷、维生素和多种对人体有用的氨基酸等化合物[2],其中黄精多糖(polygonatum sibiricum poly Saccharides)是黄精化学组成的一个重要组成部分,也是黄精主要生物学活性成分之一。
1 材料与方法
1.1 实验动物:昆明种雄性小鼠,6～8周龄,体重18～22g,购自中南大学湘雅医学院(许可证号:SCXK湘2007-2008),饲养于室内通风柜,每天正常供食及饮水。
将小鼠随机分为4组,每组20只,组间体重经t检验无显著差异。对照组、低剂量、中剂量组和高剂量组,饲养受试物量分别为:0.0、400mg/kg、800mg/kg和1200mg/kg的黄精多糖,对照组给同体积的蒸馏水。每10g体重给予受试物0.2mL,采取灌胃法,连续给予受试物28d后,测定各指标。
1.2 药品与仪器试剂
1.2.1 受试物黄精多糖的提取分离与精制[4]:取干燥的黄精根茎,打碎过15目筛网,称取粉末100g,用石油醚于80～90℃下回流脱去黄精粉末中的脂肪,直至石油醚溶剂滴在滤纸上不出现油痕为止。蒸干溶剂后,药渣用80%的乙醇浸渍过夜,于80～90℃回流提取两次,过滤,将药渣用500mL蒸馏水90℃浸提1h,再用等量蒸馏水重复浸提30min,过滤后合并滤液, 减压浓缩至150mL。用氯仿-正丁醇萃取多次,除去浓缩液中的蛋白质,并用1%的活性炭脱色2次,抽滤后的滤液加入95%乙醇使含醇量达80%,静置过夜后过滤,所得滤饼依次用95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤4次,真空干燥,得精制的黄精多糖。
1.2.2 试剂:谷氨酸和γ-氨基丁酸(Sigma公司);丹酰氯(Fluka公司);尿素氮测定试剂盒(北京化工厂)。其他试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水。
1.2.3 仪器:LC-2010岛津高效液相色谱仪(日本);YC-30超速离心机(北京安必升科技发展有限公司);752W分光光度计(上海精科实业有限公司),FA-1004分析天平(上海精科实业有限公司);游泳箱(120cm X 70cm X 80cm,自制)。
1.3 小鼠体力性疲劳模型的建立与试验方法
1.3.1 游泳试验[5]:连续给药28d,末次给予受试物30min后,在大鼠尾根部负以小鼠体重5%的铅丝,放入水温(25±0.5)℃,水深40cm的游泳箱中,用秒表记录自游泳开始至力竭(小鼠沉没后10S仍不能浮出水面)的时间作为小鼠力竭性游泳时间。
1.3.2 爬杆试验[5]:连续给药28d,末次给予受试物30min后,将小鼠放在爬杆架的有机玻璃棒上,使其肌肉处于紧张状态,记录小鼠由于肌肉疲劳从有机玻璃上跌落下来的时间。第三次跌落时终止实验,累计三次的时间作为爬杆时间。
1.4 血尿素的测定:连续给药28d,末次给予受试物30min后,将小鼠放于水温25± 1℃的游泳箱中游泳90min,休息60min后摘眼球取血,取血清用试剂盒(二乙酰一肟法)测定[6]。
1.5 血乳酸的测定:连续给药28d,末次给予受试物30min后,将小鼠放于水温30±1℃的水中负重5%游泳10min停止,分别从游泳前、游泳之后0、15、60min的小鼠眼内眦静脉丛取血。于5ml离心管中加入1% NaF溶液0.48ml,准确吸取全血20μL加入试管底部。用试管上清液冲洗微量吸管数次,再加入蛋白沉淀剂1.5ml,振荡混匀,3000r·min-1离心10min,取上清液测定。
1.6 肝糖原的测定:连续给药28d,末次给予受试物30min后,将小鼠放于水温30±1℃的水中游泳60min后停止,立即处死小鼠取出肝脏,精确称取200mg,加入TCA4ml,每管匀浆1min,3000r·min-1离心15min,取上清液转移至另一试管内。在沉淀中加入TCA4ml。匀浆1min,再次离心15min,取上清液,与第一次离心的上清液合并,充分混匀。取1ml上清液,每管加入95%的乙醇4ml,充分混匀至两种液体间不留有界面。室温放置过夜。沉淀完全后将试管于3000r·min-1离心15min。小心倒掉上清液并使试管放置10min,用1ml蒸馏水振荡溶解后测定[6]。
1.7 肌糖原的测定:连续给药28d,末次给予受试物30min后,将小鼠放于水温30±1℃的水中游泳60min后停止,立即处死小鼠取出肌肉,以0.9%NaCI溶液冲洗后,用滤纸吸干,准确称取肌肉1g,放入盛有3mL30%KOH的试管中,置沸水浴煮20min,取出冷却后,将其转移至50ml容量瓶中,用水多次洗涤试管,一并转入容量瓶,加水稀至刻度,摇匀待用。置沸水浴中10min,冷卻后在620nm波长处测量光吸收值,同时空白对照。
1.8 小鼠脑内GLu和GABA含量的HPLC测定:脑组织加蒸馏水后超声匀浆加入高氯酸,25000r·min-1离心15min,4℃取上清液,滴加KHCO3,调至pH9.8。加入丹酰氯/丙酮,加热反应40min后,滴加HCI终止反应,30000 r·min-1离心10min,取上清液进行HPLC测定。
1.9 数据统计学处理:用SPSS11.5统计软件对测量得到的数据进行处理,以 表示。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果与分析
2.1 黄精多糖对小鼠游泳时间、爬杆时间、血清尿素氮、肝糖原和肌糖原含量的影响:将实验组与对照组的实验结果相对比,高剂量组游泳时间提高了54%(P<0.01),中剂量组游泳时间提高了32%(P<0.05)。实验组与对照组相比,低剂量组爬杆时间提高了123%(P<0.001), 中剂量组爬杆时间提高了135%(p<0.001),高剂量组爬杆时间提高了294%(p<0.001)。实验组与对照组相比,高剂量组尿素氮含量降低了17%(p<0.01), 中剂量组降低了14%(p<0.05)。中剂量组肝糖原含量为对照组的2.5倍(p<0.01),高剂量组肝糖原含量为对照组的3.7倍(p<0001),见表1。实验组与对照组相比,爬杆时间和游泳时间显著提高;血清尿素氮明显降低;肝糖原含量显著性提高,表明黄精多糖具有延缓疲劳出现的作用。
2.2 黄精多糖对小鼠血乳酸含量的影响:高剂量组游泳后0min和15min实验组与对照组相比,血乳酸含量分别降低了25%(p<0.01)和25%(p<0.05),并且趋于游泳前的乳酸含量,见表2。运动后15min内血乳酸含量分别降低并趋于正常对照组,说明黄精多糖具有促进体力性疲劳消除的积极作用。
3 讨论
糖是机体最重要的能源物质,其中肌糖原是骨骼肌中可以随时动用的贮备能源,其贮备量与运动的耐力呈正相关;肝糖原的主要作用是维持血糖的相对稳定,随着运动时间的延长,血糖水平开始下降,为了补偿血糖的消耗,肝糖原分解和糖异生作用增强,一旦肝糖原耗竭,会使运动肌供能不足,导致外周疲劳。本实验结果表明黄精的抗疲劳作用可能与增加肝糖原、肌糖原的储备有关。当机体长时间不能通过糖、脂肪分解代谢得到足够能量时,机体蛋白质与氨基酸分解代谢随之增强,产生大量的尿素氮。机体血尿素氮含量随运动负荷增加而增加, 而且机体对负荷的适应性越差,产生的尿素氮越多。表明黄精可能通过抑制血清尿素氮的产生起到抗疲劳的作用。
以上实验数据表明,黄精多糖具有调整体内代谢和快速加强体质恢复,消除疲劳的作用。
参考文献
[1] 刘柳,郑芸,董群,方积年.黄精中的多糖组分及其免疫活性[J].中草药,2006,8:1132-1134
[2] 庞玉新,赵致,袁媛,付明学等.黄精的化学成分及药理作用[J].山地农业生物学报,2003,22(6):547～550
[3] 张庭廷,夏晓凯,陈传平等.黄精多糖的生物活性研究[J].中国实验方剂学杂志,2006,12(7):42-44
[4] 侯双菊, 林超群, 鲁坚,方红美等.黄精多糖提取工艺的试验研究[J].安徽化工,2006,4:20-22
[5] 江振友,刘弱,李久香等.复方中药抗疲劳作用的实验研究[J].中华实用中西医杂志,2006,19(18):2214-2215