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摘要：依据GB/T15000-2008标准样品工作导则，研制白藜芦醇标准样品。采用高速逆流色谱方法制备白藜芦醇样品，通过UV、IR、MS和NMR等方法对白藜芦醇样品进行结构鉴定，并进行均匀性、稳定性检验。采用8家实验室对制备的白藜芦醇样品进行联合定值，并对定值结果进行数据分析。白藜芦醇标准样品均匀性和稳定性良好，其定值结果为99.79%，置信度95%的扩展不确定度为0.66%。所制备的白藜芦醇样品满足标准样品工作导则的要求，可用于有关白藜芦醇检测方法的校正和相关产品的质量控制。
关键词：白藜芦醇；标准样品；定值；均匀性；稳定性
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2015）04-0039-04
0 引言
门藜芦醇是虎杖的主要功效成分，具有降血脂，抑制血小板凝聚和治疗溃疡的作用，特别是在癌症的起始、促进和发展3个主要阶段均有化学抗癌活性。白藜芦醇作为产品质量控制中的重要检测指标，广泛应用于葡萄酒、花生制品、化妆品、虎杖药材和保健品的实际检测工作中。
目前，我国尚无白藜芦醇标准样品。为了满足上述检测工作的需求，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，急需制备门藜芦醇标准样品。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
虎杖提取物，陕西瑞康生物工程有限公司；水（双蒸水），实验室自制；石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇均为分析纯。
1.2 仪器与设备
LC-20A高效液相色谱仪（配SPD-M20A检测器，日本Shimadzu公司）；TBE-300B半制备型高速逆流色谱仪（上海同田生物技术有限公司）；ALPHA l-2plus冷冻干燥机（德国CHRIST公司）；UV 1800紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；Spectrum 400傅里叶变换红外一近红外光谱仪（美国PerkinElmer公司）；1100 Series LC/MSD SL（美国Agilent公司）；500 MHz超导核磁共振谱仪（德国Bruker公司）。
1.3 白藜芦醇标准样品制备
对虎杖提取物采用高速逆流色谱法（HSCCC）分离纯化，首先使用正丁醇一乙酸乙酯一水（0.2：1：2，v/v）溶剂体系，通过连续上样的方式对门藜芦醇进行初步富集；然后使用氯仿一甲醇一水（4：3.5：2，v/v）进行二次纯化，收集门藜芦醇馏分，旋转蒸发去除溶剂，冷冻干燥后最终得到白藜芦醇样品。
对门藜芦醇样品采用4mL棕色样品瓶分装，分装是在相对独立和洁净空间进行。每瓶10mg，共计得到门藜芦醇100瓶，以1-100号计，置于4℃冰箱中长期保存。
1.4 纯度分析方法
色谱柱：Wondasil C18（150mmx4.6mmx5μm）；流动相：乙腈一水（26：74，v/v），体积流量：1.0mL/min；柱温：30℃；运行时间：30min；检测波长：305nm。
1.5 结构鉴定
采用UV、IR、MS和NMR方法对门藜芦醇进行结构鉴定。
2 结果与分析
2.1 纯度分析
采用等度HPLC对门藜芦醇样品进行洗脱，DAD检测器进行全波长扫描，扣除溶剂峰，扫描色谱图未见明显杂质色谱峰，如图l、图2所示。305nm检测波长下，对门藜芦醇样品色谱峰进行面积归一化定量，扣除溶剂峰，所得门藜芦醇纯度为99.84%。
2.2 结构鉴定
2.3 均匀性检验
根据GBIT 15000.3——2008/ISO Guide35——2006《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》要求，采用随机顺序重复测量的方法，根据随机数表，分别抽取10瓶样品进行均匀性检验。白藜芦醇样品瓶号为45，32，26，94，87，28，68，65，2，33，按照3种顺序（第1组：45-26-87-68-2-32-94-28-65-33；第2组：33-2-65-68-28-87-94-26-32-45；第3组：32-94-28-65-33-45-26-87-68-2）进行测定。分别从每瓶中称取0.25 mg样品3份，每份样品用1.0mL色谱纯甲醇溶解，按1.4纯度分析方法，以面积百分比读取样品的纯度值。检测数据进行方差分析，以F值检验，确定白藜芦醇样品的均匀性数据是否符合正态分布。检验结果见表3、表4。
2.4 稳定性检验
将门藜芦醇样品于2-8℃冰箱冷藏避光保存，以一年为期，对制备的门藜芦醇样品每3个月取样，按1.4纯度分析方法，峰面积归一化法进行纯度计算，每份试样平行测试3次，采用t检验对数据进行分析，稳定性检验结果见表5。
采用直线作为经验模型，观察斜率值是否有显著变化，以此对标准样品的稳定性变化进行预测。斜率可用下式计算：
2.5 定值
根据标准样品工作导则，采用8个实验室协作定值。随机抽取16瓶样品，每个定值实验室2瓶，每瓶平行测定3次。定值实验室将样品配成0.25mg/mL，用高效液相色谱仪测定，采用峰面积归一化法进行纯度定值。对所采集的测定结果，采用格拉布斯（Grubbs）检验法进行检验，未发现异常值，测定结果呈正态分布。经过数据统计，计算得出白藜芦醇标准样品的标准值和不确定度。定值结果见表6，定值方差分析结果见表7。
3 结束语
本文建立了白藜芦醇的分离纯化方法，制备所得门藜芦醇标准样品的均匀性、稳定性符合GB/T15000-2008标准样品工作导则要求。该标准样品的纯度标准值为99.79%，扩展不确定度（95%置信区间）为0.66%。白藜芦醇标准样品可用于虎杖药材及相关产品中门藜芦醇含量的测定，为药材和产品成分检测结果的准确性、可比性、溯源性以及质量控制提供技术支持。
关键词：白藜芦醇；标准样品；定值；均匀性；稳定性
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2015）04-0039-04
0 引言
门藜芦醇是虎杖的主要功效成分，具有降血脂，抑制血小板凝聚和治疗溃疡的作用，特别是在癌症的起始、促进和发展3个主要阶段均有化学抗癌活性。白藜芦醇作为产品质量控制中的重要检测指标，广泛应用于葡萄酒、花生制品、化妆品、虎杖药材和保健品的实际检测工作中。
目前，我国尚无白藜芦醇标准样品。为了满足上述检测工作的需求，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，急需制备门藜芦醇标准样品。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
虎杖提取物，陕西瑞康生物工程有限公司；水（双蒸水），实验室自制；石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇均为分析纯。
1.2 仪器与设备
LC-20A高效液相色谱仪（配SPD-M20A检测器，日本Shimadzu公司）；TBE-300B半制备型高速逆流色谱仪（上海同田生物技术有限公司）；ALPHA l-2plus冷冻干燥机（德国CHRIST公司）；UV 1800紫外可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；Spectrum 400傅里叶变换红外一近红外光谱仪（美国PerkinElmer公司）；1100 Series LC/MSD SL（美国Agilent公司）；500 MHz超导核磁共振谱仪（德国Bruker公司）。
1.3 白藜芦醇标准样品制备
对虎杖提取物采用高速逆流色谱法（HSCCC）分离纯化，首先使用正丁醇一乙酸乙酯一水（0.2：1：2，v/v）溶剂体系，通过连续上样的方式对门藜芦醇进行初步富集；然后使用氯仿一甲醇一水（4：3.5：2，v/v）进行二次纯化，收集门藜芦醇馏分，旋转蒸发去除溶剂，冷冻干燥后最终得到白藜芦醇样品。
对门藜芦醇样品采用4mL棕色样品瓶分装，分装是在相对独立和洁净空间进行。每瓶10mg，共计得到门藜芦醇100瓶，以1-100号计，置于4℃冰箱中长期保存。
1.4 纯度分析方法
色谱柱：Wondasil C18（150mmx4.6mmx5μm）；流动相：乙腈一水（26：74，v/v），体积流量：1.0mL/min；柱温：30℃；运行时间：30min；检测波长：305nm。
1.5 结构鉴定
采用UV、IR、MS和NMR方法对门藜芦醇进行结构鉴定。
2 结果与分析
2.1 纯度分析
采用等度HPLC对门藜芦醇样品进行洗脱，DAD检测器进行全波长扫描，扣除溶剂峰，扫描色谱图未见明显杂质色谱峰，如图l、图2所示。305nm检测波长下，对门藜芦醇样品色谱峰进行面积归一化定量，扣除溶剂峰，所得门藜芦醇纯度为99.84%。
2.2 结构鉴定
2.3 均匀性检验
根据GBIT 15000.3——2008/ISO Guide35——2006《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》要求，采用随机顺序重复测量的方法，根据随机数表，分别抽取10瓶样品进行均匀性检验。白藜芦醇样品瓶号为45，32，26，94，87，28，68，65，2，33，按照3种顺序（第1组：45-26-87-68-2-32-94-28-65-33；第2组：33-2-65-68-28-87-94-26-32-45；第3组：32-94-28-65-33-45-26-87-68-2）进行测定。分别从每瓶中称取0.25 mg样品3份，每份样品用1.0mL色谱纯甲醇溶解，按1.4纯度分析方法，以面积百分比读取样品的纯度值。检测数据进行方差分析，以F值检验，确定白藜芦醇样品的均匀性数据是否符合正态分布。检验结果见表3、表4。
2.4 稳定性检验
将门藜芦醇样品于2-8℃冰箱冷藏避光保存，以一年为期，对制备的门藜芦醇样品每3个月取样，按1.4纯度分析方法，峰面积归一化法进行纯度计算，每份试样平行测试3次，采用t检验对数据进行分析，稳定性检验结果见表5。
采用直线作为经验模型，观察斜率值是否有显著变化，以此对标准样品的稳定性变化进行预测。斜率可用下式计算：
2.5 定值
根据标准样品工作导则，采用8个实验室协作定值。随机抽取16瓶样品，每个定值实验室2瓶，每瓶平行测定3次。定值实验室将样品配成0.25mg/mL，用高效液相色谱仪测定，采用峰面积归一化法进行纯度定值。对所采集的测定结果，采用格拉布斯（Grubbs）检验法进行检验，未发现异常值，测定结果呈正态分布。经过数据统计，计算得出白藜芦醇标准样品的标准值和不确定度。定值结果见表6，定值方差分析结果见表7。
3 结束语
本文建立了白藜芦醇的分离纯化方法，制备所得门藜芦醇标准样品的均匀性、稳定性符合GB/T15000-2008标准样品工作导则要求。该标准样品的纯度标准值为99.79%，扩展不确定度（95%置信区间）为0.66%。白藜芦醇标准样品可用于虎杖药材及相关产品中门藜芦醇含量的测定，为药材和产品成分检测结果的准确性、可比性、溯源性以及质量控制提供技术支持。