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[摘要]湘莲自古以来被作为一种营养保健食品，为高蛋白、低脂肪类食物，其蛋白质含量达约17%。为了更好地开发利用湘莲蛋白质，通过测定蛋白提取率，考察碱性蛋白酶用量、提取温度、提取时间以及液料比等要素对湘莲蛋白质提取率的影响，并优化确定其最佳提取方法，即在液料比为20：1的条件下，加入1.8%的碱性蛋白酶，在50℃下提取2h，湘莲蛋白质的提取率可达92.61%，为工业生产中湘莲蛋白质的提取提供了技术支撑。
[关键词]湘莲；蛋白质；碱性蛋白酶；提取率
中图分类号：Q814.1 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180227
莲是起源较早的被子植物之一，在经典植物学分类中莲属被置于毛莨目睡莲科，世界上现存莲属有中国莲和美洲黄莲两类。据现代研究分析，莲子不仅富含糖类化合物和蛋白质，还含有丰富的钙、镁、磷，以及铁、锌、锰、铜等多种人体必需微量元素和VB、VC等人体必需的维生素，具有一定食疗功效。
湘莲起源于中国单瓣古莲的原始栽培种，与福建建莲、广昌白莲、武义昌莲合称为中国四大莲子。湘莲可被分为三大类别，分别为“寸三莲”、杂交芙蓉莲和“太空莲”，其中，以富含蛋白质但脂肪含量较低的寸三莲的质量最佳。且根据武汉商检局将寸三莲与建白莲、赣白莲以及湖莲进行的营养成分对比分析结果可发现，寸三莲在糖类化合物、蛋白质、脂肪以及钙、磷等含量上高于其他莲种，这也进一步佐证了寸三莲的优越性。而且湘莲蛋白质的营养价值也十分高，其含有较多的赖氨酸，可以弥补赖氨酸在谷类蛋白质中的缺乏，同时还包含很多粮作物中所缺失的组氨酸、精氨酸和酪氨酸，对儿童生长发育具有重大作用。然而，长期以来，我国对于湘莲产品的深加工只是停留在通心莲、糖水莲子罐头、蜜饯、莲蓉等简单工艺上，虽然刘忠义等以湘莲作为辅料、配以固体乳和奶油，研制出了营养价值高的湘莲冰淇淋，但关于湘莲蛋白质的产品开发力度不够。因此，进一步研究提取湘莲蛋白质及其综合应用具有重要意义。
目前国内外研究较多的提取蛋白质的方法有碱溶酸析、酶解提取、碱法提取、盐溶酸沉、超声提取、水酶法等，其中，酶法反应条件温和、提取时间短且可以较大程度地保留蛋白质的营养价值。根据赵东海等在对比分析酸性、中性、碱性三种蛋白酶对米糠蛋白提取的效果中发现，碱性蛋白酶的提取效果最好，说明碱性蛋白酶具有较高的酶活力和酶稳定性。本试验对碱性蛋白酶法提取湘莲蛋白质进行了单因素分析，并应用正交试验優化确定提取湘莲蛋白的最佳工艺方法。
1材料与方法
1.1材料与试剂
通心湘莲：购于湖南宏兴隆湘莲食品有限公司；碱性蛋白酶：合肥博美生物科技有限责任公司（酶活力>200U/mg）；乙醇、浓硫酸、硼酸、氢氧化钠均是分析纯。
1.2仪器与设备
ZN-400A型高速中药粉碎机，长沙市岳麓区中南制药机械厂；K-S28型电热恒温水浴锅，上海精密试验设备公司；DD5型大容量多管离心机，长沙英泰仪器有限公司；岛津AUY220分析天平（0.000 1g）；KDN-103F自动凯氏定氮仪，上海纤检仪器有限公司；PH5-3C型精密pH计，上海雷磁仪器厂。
1.3试验方法
1.3.1湘莲蛋白质提取方法
将通心湘莲干燥后进行粉碎、过100目筛，于4℃下保存。每次精准称取5g莲粉，放于250mL干燥的三角瓶，按一定的液料比加入蒸馏水后调节pH为8，加入碱性蛋白酶，摇匀，在一定温度和时间下提取湘莲蛋白质，提取完成后于80%下水浴15min，以达到灭酶效果，而后在5 000r/min的速度下将液料混合物离心15min。测定上清液体积和蛋白质含量，根据公式计算出湘莲蛋白的提取率。
1.3.2单因素试验
（1）固定酶用量为1.2%，提取温度为55℃，提取时间为2h，加入不同的液料比（5：1、10：1、15：1、20：1、25：1），讨论液料比对湘莲蛋白质提取率的影响，并确定最佳液料比。
（2）固定酶用量为1.2%，液料比为15：1，提取时间为2h，设定不同的提取温度（45℃、50℃、55℃、60℃、65℃），讨论温度对湘莲蛋白质提取率的影响，并确定最佳提取温度。
（3）固定酶用量为1.2%，液料比为15：1，提取温度为55℃，设定不同的提取时间（1h、1.5h、2h、2.5h、3h），讨论提取时间对湘莲蛋白质提取率的影响，并确定最佳提取时间。
（4）固定液料比为15：1、提取温度为55℃、提取时间为2h，加入不同的酶用量（0.5%、1%、1.2%、1.8%、2%），讨论酶用量对湘莲蛋白质提取率的影响，并确定最佳酶用量。
1.3.3正交试验设计
结合单因素试验，选取液料比、提取温度、提取时间、酶用量四项要素进行4因素3水平的正交试验，因素水平如表1。
1.3.4测定方法
湘莲粗蛋白的测定：GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》第一法。
2结果与分析
2.1莲子总蛋白含量
经试验测得，湘莲中总蛋白质含量为16.74%。
2.2单因素试验结果与分析
2.2.1酶用量对湘莲蛋白质提取率的影响
如图1所示，湘莲蛋白质的提取率在随着碱性蛋白酶用量的增加而不断提高。可能是由于酶的不断增加，提高了不溶性蛋白的溶出。但当碱性蛋白酶的用量到达1.8%后，其增加幅度趋于平缓，这是因为各种酶在特定蛋白质分子上的作用位点数目是一定的，当酶用量到达一定水平后，酶与底物作用达到饱和，再提高酶用量并不能显著加快酶促反应。因此综合考虑蛋白质提取效果和酶成本后，选取1.8%为最佳酶用量。
2.2.2液料比对湘莲蛋白质提取率的影响 如图2所示，蛋白质的提取率受液料比的影响较为明显。当加入的液料比小于20：1时，湘莲蛋白质的提取程度伴随液料比的增大而出现大幅度的增加趋势。这可能是由于加入的液体增大了酶和底物的流动性，使得酶与底物相互作用接触的机率更大。但当加入25：1的液料比时，碱性蛋白酶和底物都被稀释，反应速率降低，因而湘莲蛋白质的提取程度下降。对于工业生产而言，液料比的增大，不仅造成大量水消耗和增加废水排出量，也会对后期的干燥浓缩程序产生负担，因此，选取液料比20：1为最佳条件。
2.2.3提取时间对湘莲蛋白质提取率的影响
如图3所示，提取时间设定为1h时，被提取的湘莲蛋白质较少，可能是因为莲子粉本身需要一定时间溶胀。延迟提取时间至1.5h和2h后，蛋白质的提取率与提取1h的结果相比，都有较大的提升。这可能是因为提取时间的增长给予更多蛋白质溶出的机会，从而使蛋白提取率得到提高，2h时提取效果最好，提取率达至87%。若持续增长提取时间，酶的活力开始降低，底物也在减少，同时因为酶与底物作用饱和后，酶将会有更多的机会作用于已经溶出的蛋白质或者多肽，导致蛋白质被进一步被水解为氨基酸等小分子，提取率开始呈下降趋势。因此，选取2h為最佳提取时间。
2.2.4提取温度对湘莲蛋白质提取率的影响
如图4所示，湘莲蛋白提取率随着温度的升高呈现先缓慢上升后下降的趋势。当温度在45-60℃范围内逐渐升高时，湘莲蛋白质的提取率在小幅度增加，因为适当加大温度，可以增强碱性蛋白酶的活力，从而提高酶促反应速率。当温度升至65℃时，蛋白质的提取程度明显下降，结合曾绍校对莲子淀粉糊化动力学的研究结果：莲子淀粉在64.4下开始糊化，推测蛋白质提取率下降的原因可能是部分淀粉糊化影响了蛋白质的提取，还有可能是因为较高的温度影响了碱性蛋白酶的活性，降低了其提取蛋白质的能力。由于在50-60℃的温度范围内，蛋白质的提取率相差不大，考虑到部分蛋白质可能因为温度较高而发生变质，所以从节约能源和保持蛋白质功能特性等方面出发，选择50%为最佳提取温度。
2.3正交试验结果与分析
以单因素试验为基础，进行碱性蛋白酶提取法正交优化试验，选取液料比（V/W）、提取温度（℃）、提取时间（h）、酶用量（%）为试验因素作四因素三水平正交试验，结果如表2所示。
由表2的极差分析结果可知，各要素对湘莲蛋白质提取率的影响程度大小顺序为A>C>D>B，即液料比>提取时间>酶含量>提取温度，其优化提取工艺条件为A3C2D383，经验证试验，其湘莲蛋白质的提取率为92.01%，低于正交试验中的最优试验组合A3C2D381。所以，碱性蛋白酶法提取湘莲蛋白质的优化提取工艺取A3C2D381，即在液料比为20：1的条件下，加入1.8%的碱性蛋白酶，50%下提取2h，湘莲蛋白质的提取率为92.61%。
3结论
在用碱性蛋白酶法提取湘莲蛋白质时，各因素对湘莲蛋白提取程度的影响力大小依次是：液料比>提取时间>酶含量>提取温度。即液料比的影响力最大，提取温度的影响程度最小。并确定碱性蛋白酶法提取湘莲蛋白质的最佳方法为，在液料比为20：1的条件下，加入1.8%的碱性蛋白酶，在50℃下提取2h，湘莲蛋白质的提取率可达92.61%。
[关键词]湘莲；蛋白质；碱性蛋白酶；提取率
中图分类号：Q814.1 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180227
莲是起源较早的被子植物之一，在经典植物学分类中莲属被置于毛莨目睡莲科，世界上现存莲属有中国莲和美洲黄莲两类。据现代研究分析，莲子不仅富含糖类化合物和蛋白质，还含有丰富的钙、镁、磷，以及铁、锌、锰、铜等多种人体必需微量元素和VB、VC等人体必需的维生素，具有一定食疗功效。
湘莲起源于中国单瓣古莲的原始栽培种，与福建建莲、广昌白莲、武义昌莲合称为中国四大莲子。湘莲可被分为三大类别，分别为“寸三莲”、杂交芙蓉莲和“太空莲”，其中，以富含蛋白质但脂肪含量较低的寸三莲的质量最佳。且根据武汉商检局将寸三莲与建白莲、赣白莲以及湖莲进行的营养成分对比分析结果可发现，寸三莲在糖类化合物、蛋白质、脂肪以及钙、磷等含量上高于其他莲种，这也进一步佐证了寸三莲的优越性。而且湘莲蛋白质的营养价值也十分高，其含有较多的赖氨酸，可以弥补赖氨酸在谷类蛋白质中的缺乏，同时还包含很多粮作物中所缺失的组氨酸、精氨酸和酪氨酸，对儿童生长发育具有重大作用。然而，长期以来，我国对于湘莲产品的深加工只是停留在通心莲、糖水莲子罐头、蜜饯、莲蓉等简单工艺上，虽然刘忠义等以湘莲作为辅料、配以固体乳和奶油，研制出了营养价值高的湘莲冰淇淋，但关于湘莲蛋白质的产品开发力度不够。因此，进一步研究提取湘莲蛋白质及其综合应用具有重要意义。
目前国内外研究较多的提取蛋白质的方法有碱溶酸析、酶解提取、碱法提取、盐溶酸沉、超声提取、水酶法等，其中，酶法反应条件温和、提取时间短且可以较大程度地保留蛋白质的营养价值。根据赵东海等在对比分析酸性、中性、碱性三种蛋白酶对米糠蛋白提取的效果中发现，碱性蛋白酶的提取效果最好，说明碱性蛋白酶具有较高的酶活力和酶稳定性。本试验对碱性蛋白酶法提取湘莲蛋白质进行了单因素分析，并应用正交试验優化确定提取湘莲蛋白的最佳工艺方法。
1材料与方法
1.1材料与试剂
通心湘莲：购于湖南宏兴隆湘莲食品有限公司；碱性蛋白酶：合肥博美生物科技有限责任公司（酶活力>200U/mg）；乙醇、浓硫酸、硼酸、氢氧化钠均是分析纯。
1.2仪器与设备
ZN-400A型高速中药粉碎机，长沙市岳麓区中南制药机械厂；K-S28型电热恒温水浴锅，上海精密试验设备公司；DD5型大容量多管离心机，长沙英泰仪器有限公司；岛津AUY220分析天平（0.000 1g）；KDN-103F自动凯氏定氮仪，上海纤检仪器有限公司；PH5-3C型精密pH计，上海雷磁仪器厂。
1.3试验方法
1.3.1湘莲蛋白质提取方法
将通心湘莲干燥后进行粉碎、过100目筛，于4℃下保存。每次精准称取5g莲粉，放于250mL干燥的三角瓶，按一定的液料比加入蒸馏水后调节pH为8，加入碱性蛋白酶，摇匀，在一定温度和时间下提取湘莲蛋白质，提取完成后于80%下水浴15min，以达到灭酶效果，而后在5 000r/min的速度下将液料混合物离心15min。测定上清液体积和蛋白质含量，根据公式计算出湘莲蛋白的提取率。
1.3.2单因素试验
（1）固定酶用量为1.2%，提取温度为55℃，提取时间为2h，加入不同的液料比（5：1、10：1、15：1、20：1、25：1），讨论液料比对湘莲蛋白质提取率的影响，并确定最佳液料比。
（2）固定酶用量为1.2%，液料比为15：1，提取时间为2h，设定不同的提取温度（45℃、50℃、55℃、60℃、65℃），讨论温度对湘莲蛋白质提取率的影响，并确定最佳提取温度。
（3）固定酶用量为1.2%，液料比为15：1，提取温度为55℃，设定不同的提取时间（1h、1.5h、2h、2.5h、3h），讨论提取时间对湘莲蛋白质提取率的影响，并确定最佳提取时间。
（4）固定液料比为15：1、提取温度为55℃、提取时间为2h，加入不同的酶用量（0.5%、1%、1.2%、1.8%、2%），讨论酶用量对湘莲蛋白质提取率的影响，并确定最佳酶用量。
1.3.3正交试验设计
结合单因素试验，选取液料比、提取温度、提取时间、酶用量四项要素进行4因素3水平的正交试验，因素水平如表1。
1.3.4测定方法
湘莲粗蛋白的测定：GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》第一法。
2结果与分析
2.1莲子总蛋白含量
经试验测得，湘莲中总蛋白质含量为16.74%。
2.2单因素试验结果与分析
2.2.1酶用量对湘莲蛋白质提取率的影响
如图1所示，湘莲蛋白质的提取率在随着碱性蛋白酶用量的增加而不断提高。可能是由于酶的不断增加，提高了不溶性蛋白的溶出。但当碱性蛋白酶的用量到达1.8%后，其增加幅度趋于平缓，这是因为各种酶在特定蛋白质分子上的作用位点数目是一定的，当酶用量到达一定水平后，酶与底物作用达到饱和，再提高酶用量并不能显著加快酶促反应。因此综合考虑蛋白质提取效果和酶成本后，选取1.8%为最佳酶用量。
2.2.2液料比对湘莲蛋白质提取率的影响 如图2所示，蛋白质的提取率受液料比的影响较为明显。当加入的液料比小于20：1时，湘莲蛋白质的提取程度伴随液料比的增大而出现大幅度的增加趋势。这可能是由于加入的液体增大了酶和底物的流动性，使得酶与底物相互作用接触的机率更大。但当加入25：1的液料比时，碱性蛋白酶和底物都被稀释，反应速率降低，因而湘莲蛋白质的提取程度下降。对于工业生产而言，液料比的增大，不仅造成大量水消耗和增加废水排出量，也会对后期的干燥浓缩程序产生负担，因此，选取液料比20：1为最佳条件。
2.2.3提取时间对湘莲蛋白质提取率的影响
如图3所示，提取时间设定为1h时，被提取的湘莲蛋白质较少，可能是因为莲子粉本身需要一定时间溶胀。延迟提取时间至1.5h和2h后，蛋白质的提取率与提取1h的结果相比，都有较大的提升。这可能是因为提取时间的增长给予更多蛋白质溶出的机会，从而使蛋白提取率得到提高，2h时提取效果最好，提取率达至87%。若持续增长提取时间，酶的活力开始降低，底物也在减少，同时因为酶与底物作用饱和后，酶将会有更多的机会作用于已经溶出的蛋白质或者多肽，导致蛋白质被进一步被水解为氨基酸等小分子，提取率开始呈下降趋势。因此，选取2h為最佳提取时间。
2.2.4提取温度对湘莲蛋白质提取率的影响
如图4所示，湘莲蛋白提取率随着温度的升高呈现先缓慢上升后下降的趋势。当温度在45-60℃范围内逐渐升高时，湘莲蛋白质的提取率在小幅度增加，因为适当加大温度，可以增强碱性蛋白酶的活力，从而提高酶促反应速率。当温度升至65℃时，蛋白质的提取程度明显下降，结合曾绍校对莲子淀粉糊化动力学的研究结果：莲子淀粉在64.4下开始糊化，推测蛋白质提取率下降的原因可能是部分淀粉糊化影响了蛋白质的提取，还有可能是因为较高的温度影响了碱性蛋白酶的活性，降低了其提取蛋白质的能力。由于在50-60℃的温度范围内，蛋白质的提取率相差不大，考虑到部分蛋白质可能因为温度较高而发生变质，所以从节约能源和保持蛋白质功能特性等方面出发，选择50%为最佳提取温度。
2.3正交试验结果与分析
以单因素试验为基础，进行碱性蛋白酶提取法正交优化试验，选取液料比（V/W）、提取温度（℃）、提取时间（h）、酶用量（%）为试验因素作四因素三水平正交试验，结果如表2所示。
由表2的极差分析结果可知，各要素对湘莲蛋白质提取率的影响程度大小顺序为A>C>D>B，即液料比>提取时间>酶含量>提取温度，其优化提取工艺条件为A3C2D383，经验证试验，其湘莲蛋白质的提取率为92.01%，低于正交试验中的最优试验组合A3C2D381。所以，碱性蛋白酶法提取湘莲蛋白质的优化提取工艺取A3C2D381，即在液料比为20：1的条件下，加入1.8%的碱性蛋白酶，50%下提取2h，湘莲蛋白质的提取率为92.61%。
3结论
在用碱性蛋白酶法提取湘莲蛋白质时，各因素对湘莲蛋白提取程度的影响力大小依次是：液料比>提取时间>酶含量>提取温度。即液料比的影响力最大，提取温度的影响程度最小。并确定碱性蛋白酶法提取湘莲蛋白质的最佳方法为，在液料比为20：1的条件下，加入1.8%的碱性蛋白酶，在50℃下提取2h，湘莲蛋白质的提取率可达92.61%。