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背景:脂联素具有降低血脂、血糖,改善胰岛素敏感性的作用,但脂联素对骨骼肌糖代谢的影响尚无定论。目的:通过转染带小鼠脂联素基因的质粒,观察真核表达的脂联素对骨骼肌细胞株C2C12肌小管葡萄糖氧化和糖原合成的影响。设计:对照实验。单位:中山大学附属第二医院。材料:带小鼠脂联素cDNA的pcDNA3.0质粒,即pcDNA3.0-mad(由Dr.Da-WeiGong惠赠,University of Maryland),C2C12细胞株(ATCC,CRL-1722),rabbit anti-mouse脂联素IgG(ACRP303-A,Al-pha Diagnostic International),SABC即用型免疫组化试剂盒(博士德),D-[U-14C]葡萄糖(放射比活度9.25～13.32GBq/mmol,NEC),闪烁液POP,POPOP(Sigma),液体闪烁计数器(LS3801,Beckman,USA)。方法:实验于2003-03/08在中山大学附属第二医院中心实验室完成。①pcDNA3.0-mad质粒抽提后采用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切,及HindⅢ单酶切鉴定。②用阳离子脂质体介导分别将pcDNA3.0-mad和pcD-NA3.0空载质粒转染至C2C12细胞,并通过G418(500mg/L)筛选3周,收集G418抗性的转染后C2C12细胞,分别建立稳定转染pcD-NA3.0-mad和pcDNA3.0的C2C12细胞株。③通过Westernblot和免疫组化,鉴定C2C12细胞组、稳定转染pcDNA3.0和pcDNA3.0-mad的C2C12细胞组中有无脂联素蛋白表达。④C2C12肌细胞糖代谢实验分对照组、载体组和pcDNA3.0-mad组3组进行,每组又分别加入0,0.5,5,100nmol/L胰岛素刺激4个浓度进行观察。在加入含D-[U-14C]葡萄糖的MEM培养液孵育一定时间后,通过液闪测定细胞株C2C12肌小管糖原合成和葡萄糖氧化情况。主要观察指标:稳定转染带小鼠脂联素基因的质粒后,骨骼肌细胞株C2C12肌小管葡萄糖氧化和糖原合成量的变化。结果:①质粒转化及酶切鉴定结果:pcDNA3.0-mad质粒抽提后采用XbaⅠ和XhoⅠ双酶切,及HindⅢ单酶切鉴定。得到的质粒酶切片段与预期相符,脂联素cDNA片段长度为781bp,质粒片段长度为5446bp,脂联素cDNA被插入在真核表达载体pcDNA3.0的酶切位点XhoⅠ和XbaⅠ之间。②质粒转染C2C12细胞及阳性克隆的筛选:转染后用含G418的培养基筛选第10天,C2C12细胞绝大多数已死亡,第2周出现阳性克隆,于转染筛选后第3周收集对G418产生抗性的C2C12细胞集落。③Westernblot和免疫组化检测结果:两种检测方法均证实只有稳定转染了pcDNA3.0-mad组的细胞能表达脂联素蛋白。④稳定转染脂联素基因对肌细胞糖代谢的影响:肌细胞的糖原合成和葡萄糖氧化量随着胰岛素浓度增加而逐渐增高。线性回归分析结果为对照组、载体组和pcDNA3.0-mad组回归系数分别为23.34,23.23和26.06,即pcDNA3.0-mad组随着胰岛素浓度的增强,葡萄糖氧化量增加的速率比其他两组快;pcDNA3.0-mad组C2C12肌细胞基础状态下和胰岛素刺激下的葡萄糖氧化和糖原合成量与其他2组相近(P>0.05)。结论:①成功建立了稳定转染脂联素基因并能表达脂联素蛋白的C2C12细胞株。②转染脂联素基因对C2C12肌细胞葡萄糖氧化和糖原合成无显著性影响。③肌细胞的糖原合成和葡萄糖氧化量随着胰岛素浓度增加而逐渐增高。④脂联素可能协同胰岛素促进肌细胞葡萄糖氧化而使肌细胞摄取葡萄糖增加。