观察呼吸道合胞病毒(RSV)感染后气道上皮细胞Toll样受体4(TLR4)表达变化及其信号通路的功能,探讨RSV诱导气道炎症的机制
方法体外培养人气管上皮细胞株9HTEo,以RSV感染复数为10感染上皮细胞,用半定量逆转录PCR(RT-PCR)检测TLRl～10 mRNA表达;用定量PCR检测TLR4 mRNA表达的动态变化;用流式细胞术检测TLR4蛋白表达及与细胞凋亡的关系;感染后再用TLR4激动剂脂多糖(LPS)刺激细胞,用酶联免疫法(ELISA)检测上清液中白细胞介素-8(IL-8)含量以观察病毒诱导表达的膜TLR4蛋白功能.RT-PCR和流式细胞术实验分为正常组和RSV感染组,用GraphPad 4.0统计软件进行配对t检验;实时定量PCR实验分为正常组、RSV感染组和紫外线灭活RSV感染组,采用Kruskal-Wallis检验分析;ELISA实验分为正常组、RSV感染组、单独LPS刺激组和RSV-LPS共刺激组,采用One-way ANOVA检验分析
结果(1)RSV感染组TLR2～10 mRNA表达均上调(t值为3.49～14.47,P均＜0.05),以TLR2和TLR6变化最为显著;定量PCR结果提示:感染组TLR4 mRNA 3 h后开始增高(Kruskal-Wallis检测值=8.82,P＜0.05,n=6),紫外灭活RSV组TLR4 mRNA表达无明显变化;(2)流式细胞术结果表明:RSV感染组膜上TLR4表达比正常组增高(平均荧光强度:1.27±0.48,0.97±0.25,t:2.39,P＞0.05,n=10),感染组胞内TLR4表达比正常组降低(平均荧光强度:3.08±1.38,3.36±1.31;t=2.92,P＞0.05,n=10),感染组膜TLR4阳性细胞中(93.32±1.7)%为膜黏连蛋白-5阳性细胞;(3)RSV-LPS共刺激组培养上清液中IL-8含量明显高于单纯LPS刺激组(F=59.29,P＜0.01,n=3)
结论RSV感染后,上皮细胞TLR4mRNA和蛋白表达水平上调,与TLR4信号通路相关的IL-8分泌增加;TLR4与上皮细胞凋亡的关系提示TLR4及其信号通路可能参与了RSV诱导的上皮细胞急、慢性炎症反应.