【摘 要】
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目的克隆幽门螺杆菌(H.pylori)全长hpaA基因,构建表达HpaA蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌,并研究其对小鼠的免疫保护作用.方法用PCR扩增全长hpaA基因,经适当的酶切-连接反应将
【基金项目】
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卫生部临床学科重点项目;广东省科技厅科技计划;广东省自然科学基金;广东省教育厅千百十工程优秀人才培养基金
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目的克隆幽门螺杆菌(H.pylori)全长hpaA基因,构建表达HpaA蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌,并研究其对小鼠的免疫保护作用.方法用PCR扩增全长hpaA基因,经适当的酶切-连接反应将其连入原核表达质粒pTrc99A,并进行了基因测序.重组质粒经鉴定后再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261,提取重组菌质粒,PCR和酶切鉴定,筛选阳性克隆.用SDS-PAGE电泳和Western blot进行HpaA表达分析和鉴定,用薄层扫描分析HpaA含量.重组菌3×108CFU/0.4ml/只免疫C57BL/6小鼠,4周后H.pylori SS1 105CFU/只攻击小鼠,再5周后处死小鼠,取腺胃做快速尿素酶试验和Giemsa染色,以明确H.pylori定植情况,对照观察免疫保护效果.结果经PCR和酶切证实,构建了含783bp hpaA基因的重组原核表达质粒pTrc99A-hpaA,并将后者成功转化了减毒鼠伤寒沙门氏菌.重组菌能表达约30kDa HpaA蛋白,重组HpaA量约占全菌体蛋白量的38.9%,Western blot证实其有免疫反应性.重组菌对小鼠免疫保护率为43.48% (10/23),与空白对照组比统计差异显著(P=0.01).结论构建了表达H.pylori HpaA 的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌,该菌株对C57BL/6小鼠有免疫保护作用.
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