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[摘要] 目的 觀察辅助性T 细胞17（Th17）/调节性T细胞（Terg）免疫失衡在来风湿关节炎患者发病时的作用，探讨血清中期因子（MK）和Th17/调节性T细胞对类风湿关节炎患者病情发生发展的影响。方法 选取2013年3月～ 2016年1月在我院接受治疗的类风湿关节炎患者58例，分为活动组和非活动组，DAS28≤3.2为非活动组，DAS28>3.2为活动组，另将30例健康患者作为对照组，活动组患者32例，非活动组患者26例，采用酶联免疫吸附法对3组患者的血清MK、白介素-17（IL-17）、白介素-6（IL-6）、白介素-23（IL-23）水平进行检测，利用流式细胞术检测调节性T细胞和外周血Th17细胞的比例变化，并对其比例变化和血清MK、IL-17、IL-6、IL-23的水平进行比较。结果 活动组Th17、调节性T细胞比例分别与非活动组相比较差异具有统计学意义（P<0.05），活动组与非活动组的Th17、调节性T细胞比例分别与对照组相比较异具有统计学意义（P<0.05）。活动组与非活动组的IL-17、IL-6和IL-23水平分别与对照组相比较异具有统计学意义（P<0.05）。血清MK与Th17、T细胞的百分比和平衡相关的相关性结果显示，Th17和Treg均与血清MK无关，P>0.05，而与STAT5成负相关（P<0.05）。结论 类风湿性关节炎患者的血清MK上升，且类风湿性关节炎患者Th17/Terg平衡中Th17相对增高，而Terg会相对降低，MK的上升和Th17/Terg平衡失调都促进了RA的发生发展。
[关键词] MK；Th17；调节性T细胞；类风湿关节炎
[中图分类号] R593.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）15-107-03
[Abstract] Objective To explore the effect of immune imbalance of T helper cell 17（Th17） and regulatory T cell（Terg） on attack of patients with rheumatoid arthritis and to explore the effect of serum midkine（MK）， Th17 and regulatory T cell on the occurrence and development of patients with rheumatoid arthritis. Methods 58 patients with rheumatoid arthritis who were admitted to our hospital from March 2013 to January 2016 were selected. They were divided into the active group（DAS28>3.2） and the inactive group（DAS28≤3.2）. Other 30 healthy people were selected as the control group. There were 32 cases in the active group and 26 cases in the inactive group. Levels of serum MK， Interleukin-17（IL-17）， Interleukin-6（IL-6） and Interleukin-23（IL-23） were detected by enzyme linked immunosorbent assay. Changes of ratio of regulatory T cell and peripheral blood（Th17） were detected by flow cytometry. In addition， changes of ratio and levels of MK， IL-17， IL-6 and IL-23 were compared. Results Th17 and regulatory T cell ratio in the active group and the inactive group had respectively comparative difference and the difference was statistically significant（P<0.05）. The active group and the inactive group had respectively comparative differences with the control group in Th17 and regulatory T cell ratio and differences were statistically significant（P<0.05）. Levels of IL-17， IL-6 and IL-23 of the active group and the inactive group had respectively comparative differences with the control group and differences were statistically significant（P<0.05）. Percentage of serum MK and Th17， percentage of serum MK and T cell and results of correlation related to balance showed that Th17 and Terg were both had no relation with serum MK， P>0.05 while they were negatively correlated with STAT5（P<0.05）. Conclusion Serum MK of patients with rheumatoid arthritis increases， Th17 in balance of Th17 and Terg relatively increase and Terg relatively decreases. Increase of MK and imbalance of Th17 and Terg both promote the occurrence and development of RA. [Key words] MK； Th17； Regulatory T cell； Rheumatoid arthritis
类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病[1]，目前认为是感染引起遗传易感个体的A身免疫反应，其病理生理的改变主要由前炎性CD4+的Thl介导[2-3]。类风湿关节炎患者辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）细胞相对升高，而调节性T细胞（Regulatory cell，Terg）则相对下降，Th17/Treg细胞有所偏倚，而导致两群细胞比例异常的重要因素与白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-23（Interleukin-23，IL-23）和白介素-17（Interleukin-17，IL-17）等相关细胞因子的异常有关[4-5]。 调节性T细胞调节 Th17 细胞分化的重要机制是 RORγt 和Foxp3 平衡被打破，在一定程度上抑制了Th17 细胞的分化。Thl7/Terg平衡相关因子主要包括叉状头转录因子（Foxp3）、信号传导与转录激活因子（STAT3）、维甲酸相关孤核受体转录因子（RORγτ）、STAT5 mRNA[6-7]，本文将探讨血清MK和Th17/调节性T细胞对类风湿关节炎患者病情发生发展的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2013年3月～2016年1月在我院接受治疗的类风湿关节炎患者58例，RA患者根据美国风湿学会1987年的RA分类标准及疾病活动度DAS28评分，分为活动组和非活动组，DAS28≤3.2组为非活动组，DAS28>3.2为活动组，另将30例健康患者作为对照组，活动组患者32例，非活动组患者26例，RA患者病程2 ～ 13年，活动组患者男18例，女14例，平均年龄（56±13）岁，非活动组患者男16例，女10例，平均年龄（58±11）岁，健康组男17例，女13例，平均年龄（58±15）岁。三组患者性别、年龄等一般资料比较无统计学差异（P>0.05）。纳入标准：（1）健康组人员无相关自身免疫性疾病、肿瘤或近期感染史，且年龄和性别与RA组匹配。（2）近3个月内避免使用免疫抑制剂或激素。排除标准：（1）合并其他风湿性疾病；（2）合并其他慢性疾病；（3）明显血液学指标异常。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂和仪器 奥地利产Sunrise TECAN型酶标，杭州四季清公司产胎牛血清。IL-17、IL-16、IL-23、TGF-B ELISA试剂盒均购自美国R&D公司，KDC-40低速离心机。
1.2.2 检测方法 检测细胞因子：首先测定患者血清和关节液，并对对照组血清中的IL-17、IL-23、IL-6水平进行检测，按照说明书进行操作，使用酶标仪检测各孔OD值，以空白孔均值调零。检测Th17：采用流式细胞术进行检测，用RPMll640稀释后，再加入25μL PMA、20μL Ionomy-cin，37℃孵育5h左右。设同型对照管（A管）和检测管（B管），每管分别加入2.5μL CD-PerCP和2.5L CD8-FITC，在避光条件下进行孵育约15min，加入Reagent A，在避光条件下放置约15min。清洗后，两只试管都加入100μLFix&Penn中的溶血液和破膜。在避光条件下放置约15min后清洗，清洗后加500 μL PBS重悬。流式细胞术检测Treg：将肝素钠抗凝全血50μL加入10μLFITC-CD4/APC-CD25。溶血洗涤后弃上清，使用1mL新鲜配置的Fixation/Permmeabilization液混匀，在温度为4℃条件下进行孵育2h。洗涤后，加入1μL正常鼠血清于4℃避光封闭15min，并加入10μL PE.抗人Foxp3mAb于4℃避光孵育30min，经洗涤后，用500μL染色缓冲液重悬，上机分析。
1.3 统计学方法
采用SPSS 15.0软件进行数据分析。计数资料以频数表示，比较采用χ2检验；计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 三组患者Th17和調节性T细胞比例比较
活动组Th17、调节性T细胞比例分别与非活动组相比较差异具有统计学意义，活动组与非活动组的Th17、调节性T细胞比例分别与对照组相比较均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 三组患者IL-17、IL-6和IL-23比较
活动组IL-17、IL-6和IL-23水平分别与非活动组相比较差异具有统计学意义（P<0.05），活动组与非活动组的IL-17、IL-6和IL-23水平分别与对照组相比较异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 血清中期因子（midkine，MK）与Th17、T细胞的百分比和平衡相关的相关性
3 讨论
RA是一种慢性自身免疫性疾病，研究者发现Thl7是能够分泌IL-17的Th细胞亚群[8-9]。Treg细胞是淋巴细胞中的一个重要组分，它们可通过抑制自身反应性T细胞的功能而发挥免疫调节作用，维持机体的免疫稳定而不至于发生自身免疫病。MK是一种肝素结合生长/分化因子，在肿瘤发生、发展以及预后过程中具有很重要的影响[10-11]。
调控Th17细胞分化的转录因子有很多，但最重要的就是RORγτ，这种因子会促进Th17生成，同时，RORγτ得一个关键的活化信号就是信号传导与转录激活因子，信号传导与转录激活因子会促进RORγτ的分化，也会促进Th17生成，因此我们通常认为信号传导与转录激活因子是Th17的调节因子[12-13]。本研究中，三组患者Th17和调节性T细胞比例比较结果显示，活动组Th17、调节性T细胞比例分别与非活动组相比较差异具有统计学意义（P<0.05），活动组与非活动组的Th17、调节性T细胞比例分别与对照组相比较异具有统计学意义（P<0.05），这说明Th17/Treg细胞亚群失衡在RA发病中具有很大影响。目前不少学者的研究已经证明，无论是啮齿类动物还是人类，IL-6和IL-17都是Thl7细胞生长发育主要的细胞因子[14-15]，本实验用ELISA法测定RA患者外周血分离血清中IL-6和IL-17的浓度，发现RA患者血清中IL-6和IL-17浓度均高于对照组。同时，本研究还发现，血清MK与Th17和Treg均无相关性，而与STAT5成负相关。 综上，类风湿关节炎患者的血清MK升高，且类风湿性关节炎患者Th17/Terg平衡中Th17相对增高，而Terg会相对降低，MK的升高和Th17/Terg平衡失调可能共同参与并促进了RA的发生发展。
[参考文献]
[1] 寇巍，胡国华，姚红兵，等.STAT3 及 SOCS3 在鼻息肉患者中对Th17 分化的作用观察[J].免疫学杂志，2012，28（10）：888-891.
[2] 于天一，孔庆喜，陈丽姝，等.类风湿性关节炎的病理机制浅析[J].黑龙江医药，2014，27（1）：33-46.
[3] 朱跃兰，刘小平，王华新.类风湿性关节炎中医应对策略[J].现代中医临床，2014，21（1）：1-5.
[4] 范蓉，王新云.类风湿性关节炎的研究进展[J].医学综述，2014，20（11）：2014-2016.
[5] 陈疆，熊新贵，梁清华.类风湿性关节炎患者关节滑膜组织蛋白质组学[J].中国组织工程研究，2012，16（28）：5206-5211.
[6] Spocrl D，Duroux-Richard I，Louis-Plence P，et al.Therole of miR-155 in regulatory T cells and rheumatoidarthritis[J].Clin Immunol，2013，148（1）：56-65.
[7] Hu w'Tmutman TD，Edukulla，et a1.Prifenzhong micruenvimnmentsdictate cytokine requirements for T helper 17 cellfineage commit-ment[J].Immunity，2011，35（6）：1010-1022.
[8] 于艷辉，李鹏飞，卢思广.转化生长因子-β1 和白介素-6 对 CD4+～CD25+ T 细胞表型、细胞因子分泌及功能的影响[J].临床儿科杂志，2013，31（3）：250-253.
[9] 寇巍，胡国华，姚红兵，等.STAT3 及 SOCS3 在鼻息肉患者中对Th17 分化的作用观察[J].免疫学杂志，2012，28（10）：888-891.
[10] Sun L，Yi SN，Chen L.Effects of Foxp3 knockdown on the functions ofhuman regulatory T cells.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2011，91（11）：2124-2128.
[11] Chavele KM，Ehrenstein MR.Regulatory T-cells in systemic lupus ery-thematosus and rheumatoid arthritis[J].FEBS Lett，2011，585（7）：3603-3610.
[12] 陈瑞林，陶怡，黄文辉，等.大鼠胶原诱导性关节炎滑膜Treg/Thl7平衡及TNF-a拮抗剂的影响[J].中国病理生理杂志，2012，28（6）：1071-1075.
[13] Eskan MA，Jotwani R，Abe T，et a1.The leukocyte integrinantago-nist Del-1 inhibits IL一17·mediated inflammatory bone loss[J].Natlmmunol，2012，13（5）：465-473.
[14] Quintana FJ，Jin H，Burns EJ，et a1.Aiolos promotes THl7 differentiation by directly silencingIL-2expression[J].Nat Immunol，2012，13（8）：770-777.
[15] 黄传兵，刘健.新风胶囊治疗类风湿性关节炎疗效观察[J].中国中西医结合杂志，2013，33（12）：1599-1602.
（收稿日期：2017-04-13）
[关键词] MK；Th17；调节性T细胞；类风湿关节炎
[中图分类号] R593.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）15-107-03
[Abstract] Objective To explore the effect of immune imbalance of T helper cell 17（Th17） and regulatory T cell（Terg） on attack of patients with rheumatoid arthritis and to explore the effect of serum midkine（MK）， Th17 and regulatory T cell on the occurrence and development of patients with rheumatoid arthritis. Methods 58 patients with rheumatoid arthritis who were admitted to our hospital from March 2013 to January 2016 were selected. They were divided into the active group（DAS28>3.2） and the inactive group（DAS28≤3.2）. Other 30 healthy people were selected as the control group. There were 32 cases in the active group and 26 cases in the inactive group. Levels of serum MK， Interleukin-17（IL-17）， Interleukin-6（IL-6） and Interleukin-23（IL-23） were detected by enzyme linked immunosorbent assay. Changes of ratio of regulatory T cell and peripheral blood（Th17） were detected by flow cytometry. In addition， changes of ratio and levels of MK， IL-17， IL-6 and IL-23 were compared. Results Th17 and regulatory T cell ratio in the active group and the inactive group had respectively comparative difference and the difference was statistically significant（P<0.05）. The active group and the inactive group had respectively comparative differences with the control group in Th17 and regulatory T cell ratio and differences were statistically significant（P<0.05）. Levels of IL-17， IL-6 and IL-23 of the active group and the inactive group had respectively comparative differences with the control group and differences were statistically significant（P<0.05）. Percentage of serum MK and Th17， percentage of serum MK and T cell and results of correlation related to balance showed that Th17 and Terg were both had no relation with serum MK， P>0.05 while they were negatively correlated with STAT5（P<0.05）. Conclusion Serum MK of patients with rheumatoid arthritis increases， Th17 in balance of Th17 and Terg relatively increase and Terg relatively decreases. Increase of MK and imbalance of Th17 and Terg both promote the occurrence and development of RA. [Key words] MK； Th17； Regulatory T cell； Rheumatoid arthritis
类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病[1]，目前认为是感染引起遗传易感个体的A身免疫反应，其病理生理的改变主要由前炎性CD4+的Thl介导[2-3]。类风湿关节炎患者辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）细胞相对升高，而调节性T细胞（Regulatory cell，Terg）则相对下降，Th17/Treg细胞有所偏倚，而导致两群细胞比例异常的重要因素与白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-23（Interleukin-23，IL-23）和白介素-17（Interleukin-17，IL-17）等相关细胞因子的异常有关[4-5]。 调节性T细胞调节 Th17 细胞分化的重要机制是 RORγt 和Foxp3 平衡被打破，在一定程度上抑制了Th17 细胞的分化。Thl7/Terg平衡相关因子主要包括叉状头转录因子（Foxp3）、信号传导与转录激活因子（STAT3）、维甲酸相关孤核受体转录因子（RORγτ）、STAT5 mRNA[6-7]，本文将探讨血清MK和Th17/调节性T细胞对类风湿关节炎患者病情发生发展的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2013年3月～2016年1月在我院接受治疗的类风湿关节炎患者58例，RA患者根据美国风湿学会1987年的RA分类标准及疾病活动度DAS28评分，分为活动组和非活动组，DAS28≤3.2组为非活动组，DAS28>3.2为活动组，另将30例健康患者作为对照组，活动组患者32例，非活动组患者26例，RA患者病程2 ～ 13年，活动组患者男18例，女14例，平均年龄（56±13）岁，非活动组患者男16例，女10例，平均年龄（58±11）岁，健康组男17例，女13例，平均年龄（58±15）岁。三组患者性别、年龄等一般资料比较无统计学差异（P>0.05）。纳入标准：（1）健康组人员无相关自身免疫性疾病、肿瘤或近期感染史，且年龄和性别与RA组匹配。（2）近3个月内避免使用免疫抑制剂或激素。排除标准：（1）合并其他风湿性疾病；（2）合并其他慢性疾病；（3）明显血液学指标异常。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂和仪器 奥地利产Sunrise TECAN型酶标，杭州四季清公司产胎牛血清。IL-17、IL-16、IL-23、TGF-B ELISA试剂盒均购自美国R&D公司，KDC-40低速离心机。
1.2.2 检测方法 检测细胞因子：首先测定患者血清和关节液，并对对照组血清中的IL-17、IL-23、IL-6水平进行检测，按照说明书进行操作，使用酶标仪检测各孔OD值，以空白孔均值调零。检测Th17：采用流式细胞术进行检测，用RPMll640稀释后，再加入25μL PMA、20μL Ionomy-cin，37℃孵育5h左右。设同型对照管（A管）和检测管（B管），每管分别加入2.5μL CD-PerCP和2.5L CD8-FITC，在避光条件下进行孵育约15min，加入Reagent A，在避光条件下放置约15min。清洗后，两只试管都加入100μLFix&Penn中的溶血液和破膜。在避光条件下放置约15min后清洗，清洗后加500 μL PBS重悬。流式细胞术检测Treg：将肝素钠抗凝全血50μL加入10μLFITC-CD4/APC-CD25。溶血洗涤后弃上清，使用1mL新鲜配置的Fixation/Permmeabilization液混匀，在温度为4℃条件下进行孵育2h。洗涤后，加入1μL正常鼠血清于4℃避光封闭15min，并加入10μL PE.抗人Foxp3mAb于4℃避光孵育30min，经洗涤后，用500μL染色缓冲液重悬，上机分析。
1.3 统计学方法
采用SPSS 15.0软件进行数据分析。计数资料以频数表示，比较采用χ2检验；计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 三组患者Th17和調节性T细胞比例比较
活动组Th17、调节性T细胞比例分别与非活动组相比较差异具有统计学意义，活动组与非活动组的Th17、调节性T细胞比例分别与对照组相比较均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 三组患者IL-17、IL-6和IL-23比较
活动组IL-17、IL-6和IL-23水平分别与非活动组相比较差异具有统计学意义（P<0.05），活动组与非活动组的IL-17、IL-6和IL-23水平分别与对照组相比较异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 血清中期因子（midkine，MK）与Th17、T细胞的百分比和平衡相关的相关性
3 讨论
RA是一种慢性自身免疫性疾病，研究者发现Thl7是能够分泌IL-17的Th细胞亚群[8-9]。Treg细胞是淋巴细胞中的一个重要组分，它们可通过抑制自身反应性T细胞的功能而发挥免疫调节作用，维持机体的免疫稳定而不至于发生自身免疫病。MK是一种肝素结合生长/分化因子，在肿瘤发生、发展以及预后过程中具有很重要的影响[10-11]。
调控Th17细胞分化的转录因子有很多，但最重要的就是RORγτ，这种因子会促进Th17生成，同时，RORγτ得一个关键的活化信号就是信号传导与转录激活因子，信号传导与转录激活因子会促进RORγτ的分化，也会促进Th17生成，因此我们通常认为信号传导与转录激活因子是Th17的调节因子[12-13]。本研究中，三组患者Th17和调节性T细胞比例比较结果显示，活动组Th17、调节性T细胞比例分别与非活动组相比较差异具有统计学意义（P<0.05），活动组与非活动组的Th17、调节性T细胞比例分别与对照组相比较异具有统计学意义（P<0.05），这说明Th17/Treg细胞亚群失衡在RA发病中具有很大影响。目前不少学者的研究已经证明，无论是啮齿类动物还是人类，IL-6和IL-17都是Thl7细胞生长发育主要的细胞因子[14-15]，本实验用ELISA法测定RA患者外周血分离血清中IL-6和IL-17的浓度，发现RA患者血清中IL-6和IL-17浓度均高于对照组。同时，本研究还发现，血清MK与Th17和Treg均无相关性，而与STAT5成负相关。 综上，类风湿关节炎患者的血清MK升高，且类风湿性关节炎患者Th17/Terg平衡中Th17相对增高，而Terg会相对降低，MK的升高和Th17/Terg平衡失调可能共同参与并促进了RA的发生发展。
[参考文献]
[1] 寇巍，胡国华，姚红兵，等.STAT3 及 SOCS3 在鼻息肉患者中对Th17 分化的作用观察[J].免疫学杂志，2012，28（10）：888-891.
[2] 于天一，孔庆喜，陈丽姝，等.类风湿性关节炎的病理机制浅析[J].黑龙江医药，2014，27（1）：33-46.
[3] 朱跃兰，刘小平，王华新.类风湿性关节炎中医应对策略[J].现代中医临床，2014，21（1）：1-5.
[4] 范蓉，王新云.类风湿性关节炎的研究进展[J].医学综述，2014，20（11）：2014-2016.
[5] 陈疆，熊新贵，梁清华.类风湿性关节炎患者关节滑膜组织蛋白质组学[J].中国组织工程研究，2012，16（28）：5206-5211.
[6] Spocrl D，Duroux-Richard I，Louis-Plence P，et al.Therole of miR-155 in regulatory T cells and rheumatoidarthritis[J].Clin Immunol，2013，148（1）：56-65.
[7] Hu w'Tmutman TD，Edukulla，et a1.Prifenzhong micruenvimnmentsdictate cytokine requirements for T helper 17 cellfineage commit-ment[J].Immunity，2011，35（6）：1010-1022.
[8] 于艷辉，李鹏飞，卢思广.转化生长因子-β1 和白介素-6 对 CD4+～CD25+ T 细胞表型、细胞因子分泌及功能的影响[J].临床儿科杂志，2013，31（3）：250-253.
[9] 寇巍，胡国华，姚红兵，等.STAT3 及 SOCS3 在鼻息肉患者中对Th17 分化的作用观察[J].免疫学杂志，2012，28（10）：888-891.
[10] Sun L，Yi SN，Chen L.Effects of Foxp3 knockdown on the functions ofhuman regulatory T cells.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2011，91（11）：2124-2128.
[11] Chavele KM，Ehrenstein MR.Regulatory T-cells in systemic lupus ery-thematosus and rheumatoid arthritis[J].FEBS Lett，2011，585（7）：3603-3610.
[12] 陈瑞林，陶怡，黄文辉，等.大鼠胶原诱导性关节炎滑膜Treg/Thl7平衡及TNF-a拮抗剂的影响[J].中国病理生理杂志，2012，28（6）：1071-1075.
[13] Eskan MA，Jotwani R，Abe T，et a1.The leukocyte integrinantago-nist Del-1 inhibits IL一17·mediated inflammatory bone loss[J].Natlmmunol，2012，13（5）：465-473.
[14] Quintana FJ，Jin H，Burns EJ，et a1.Aiolos promotes THl7 differentiation by directly silencingIL-2expression[J].Nat Immunol，2012，13（8）：770-777.
[15] 黄传兵，刘健.新风胶囊治疗类风湿性关节炎疗效观察[J].中国中西医结合杂志，2013，33（12）：1599-1602.
（收稿日期：2017-04-13）