大鼠LC3B荧光融合表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的自噬检测应用

• 作 者: 廖翠玲 章淼锋 孙继红 董江军 朱园园 叶招明 邹飞雁
• 机 构: 510632 广州，暨南大学生命科学技术学院发育与再生生物学系,310009 杭州，浙江大学医学院附属浙二医院骨科,310016 杭州，浙江大学医学院附属邵逸夫医院放射科,312300 绍兴，上虞人民
• 出 处: 中华骨科杂志
• 发表日期: 2017年37期
• 关键词: Autophagy Cloning molecular Fluorescent antibody technique

目的

构建三种rLC3B融合表达载体，探究其在骨肉瘤细胞中的自噬检测应用。

方法

采用PCR扩增大鼠LC3B基因序列，克隆至pEGFP-C1和pmCherry-C1，分别构建pEGFP-rLC3B和pmCherry-rLC3B融合表达载体；随后以pEGFP-rLC3B为模板经PCR得到EGFP-rLC3B序列，克隆至pmCherry-C1并构建pmCherry-EGFP-rLC3B融合表达载体。将上述三种质粒转染至U-2 OS细胞后，采用饥饿和Rapamycin激活自噬，或Chloroquine和Baf-A1抑制自噬，通过激光共聚焦显微镜观察自噬体和自噬溶酶体的形成。采用Western blot检测Rapamycin、Chloroquine和Baf-A1作用下的内源性LC3B和外源性EGFP-rLC3B、mCherry-rLC3B及mCherry-EGFP-rLC3B，验证外源性rLC3B的正确表达和自噬检测功能；采用Western blot检测游离EGFP表达，从而精确检测细胞内的自噬性降解水平。

结果

经酶切鉴定和测序验证：成功构建三种融合表达载体。采用饥饿和Rapamycin激活自噬，或Chloroquine和Baf-A1抑制自噬，并在激光共聚焦显微镜下观察到明显的自噬体或自噬溶酶体。Western blot同时检测到内源LC3B和外源rLC3B的表达，并且游离EGFP蛋白的表达随着饥饿时间增加而明显上调，12 h组比对照组增加1.05倍，24 h组比对照组增加1.56倍，显示自噬性降解水平升高。

结论

EGFP-rLC3B载体可检测自噬体的形成和反应细胞内的自噬性降解水平；mCherry-rLC3B载体可同时显示自噬体和自噬溶酶体，但不能区分这两者；mCherry-EGFP-rLC3B载体可同时显示和区分自噬体和自噬溶酶体，是检测自噬流的最佳方法。