【摘 要】
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目的 探讨胃泌素促进人大肠癌细胞侵袭力增加的分子机制.方法 脂质体转染表达胃泌素受体(CCK-2R)的pCR3.1/GR质粒于结肠癌细胞Colo320中,G418筛选出稳定表达CCK-2R的阳性克隆
【机 构】
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武汉大学人民医院消化内科,湖北中医学院中医药实验中心
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目的 探讨胃泌素促进人大肠癌细胞侵袭力增加的分子机制.方法 脂质体转染表达胃泌素受体(CCK-2R)的pCR3.1/GR质粒于结肠癌细胞Colo320中,G418筛选出稳定表达CCK-2R的阳性克隆,逆转录PCR和免疫印迹鉴定,转染成功命名为Colo320WT.应用1×10-8 mol/L胃泌素以时间梯度0、1、6、12、48、48 h干预Colo320WT细胞,同时应用胃泌素受体拮抗剂L365,260干预Colo320WT细胞30 min,再加1×10-8 mol/L胃泌素干预12 h.免疫印迹检测Colo320WT细胞中的磷酸化黏着斑激酶(FAK)Tyr397和总FAK表达.共聚焦显微镜观察磷酸化FAKTyr397在板状伪足的定位表达.免疫共沉淀检测FAK-Src-p130Cas-Dock180信号复合物的形成.Pull-down测定Rac活性.结果 随着胃泌素干预时间的延长,磷酸化FAKTyr397的表达量呈增加趋势,且12 h达最大,但对总的FAK无明显影响,磷酸化的FAKTyr397/FAK比值分别为2.82%、9.28%、22.62%、38.59%、28.41%、14.94%.L365,260阻断后的磷酸化的FAKTyr397/FAK的比值为7.21%.定位在板状伪足上磷酸化的FAKTyr397也呈增加趋势,12 h达最大.免疫共沉淀检测发现FAK、Src、p130Cas和Dock180在胃泌素的干预下形成了信号复合物.Pull-down测定证明胃泌素能活化Rac,但对总Rac表达无影响.胃泌素受体拮抗剂L365,260阻断可胃泌素引起的效应.结论 胃泌素能增加大肠癌细胞的侵袭力可能是通过其与受体作用后使FAK发生磷酸化,促进磷酸化FAKTyr397定位在板状伪足、使FAK-Src-p130Cas-Dock180信号复合物形成以及活化Rac.
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