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摘要： 采用组织培养技术，在非洲紫罗兰组培过程中的愈伤组织诱导、芽的分化、生根阶段分别进行不同浓度卡那霉素（Kan）的抗性筛选。结果表明，在愈伤组织诱导阶段，Kan浓度为60 mg/L时外植体的愈伤诱导受到抑制；在芽的分化阶段，Kan浓度为80 mg/L时芽的增殖受到抑制；在生根阶段，Kan浓度为120 mg/L时生根受到抑制。
关键词： 卡那霉素；抗性筛选；非洲紫罗兰
中图分类号： S681.204 .3 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0056-02
自1983年成功获得转基因烟草以来 [1]，关于转基因的研究越来越多，世界转基因市场总收入超过30 000亿美元，仅转基因植物种子的收入可达3 000亿美元 [2]。目前已成功获得200多种转基因植物，3 000多例转基因植物已进入大田试验阶段 [3]。在植物的转基因研究中，npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因常被作为选择标记基因，该基因编码氨基糖苷-3′-磷酸转移酶（aminnoglycoside-3′-phosphotransferase）Ⅱ，又称npt-Ⅱ（neomycin phosphotransferaseⅡ），该酶使氨基糖苷类抗生素（卡那霉素、新霉素、巴龙霉素G418等）磷酸化而失活 [4]；因此，npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因可用作遗传转化过程中区分转基因、非转基因植物细胞的标记 [5]。卡那霉素（kanamycin，Kan）影响线粒体和叶绿体的核糖体70S起始复合物生成，使蛋白质合成受阻，最终导致细胞死亡 [6]。根据其特性，对以npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因为选择标记基因的转基因后代株系进行筛选，后代发生分离，含目的基因的株系一定携带npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因，对卡那霉素处理不敏感；不含目的基因的植株不具有卡那霉素抗性，对卡那霉素处理敏感。目前，利用Kan对转基因株系进行筛选已经应用于水稻、小麦、棉花、番茄等作物 [7]。不同植物、不同类型的外植体应使用不同浓度的卡那霉素，使其有效抑制未转化成功的细胞生长并使之缓慢死亡，又不影响转化成功的细胞正常生长。抗生素浓度过低虽不影响转化株的正常生长，但可能出现嵌合体和假阳性现象；抗生素浓度过高则毒性过强，会快速杀死细胞，而死细胞对邻近活细胞常有较强的抑制作用，不利于转化细胞的生长 [8]。非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha）为非洲苦苣苔科多年生草本植物，原产于非洲坦桑尼亚海拔700～1 000 m [JP3]的乌桑巴拉山，是一种观赏价值较高的室内盆栽花卉，被誉为“室内花卉皇后” [9-10]。植物基因工程不仅广泛应用于农作物的改良，也是花卉改良的主要手段，[JP2]本试验确定了非洲紫罗兰组培体系中的卡那霉素抗性筛选浓度，为进一步的转基因研究提供依据，并为花卉品种的改良提供全新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
非洲紫罗兰组培苗（组培室培养）、卡那霉素、6-BA、NAA。生芽培养基配方为：MS、0.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA。生根培养基配方为：1/2MS、0.01 mg/L NAA。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织的诱导 配制诱导愈伤组织的培养基时，分别加入浓度为20、40、60、80、100 mg/L的Kan，同一浓度至少配制6瓶培养基。挑选生命力强的组培苗叶片，将其切成小方块并接种至不同Kan浓度的培养基中，各瓶接种相同数量的外植体。置于组培室中，在25 ℃下光照培养约20 d，定期观察并记录。
1.2.2 芽的分化 配制芽分化培养基时，分别加入浓度为20、40、60、80、100 mg/L的Kan，同一浓度至少配制6瓶培养基。将非洲紫罗兰的不定芽接种至不同Kan浓度的芽增殖培养基中，各瓶接种相同数量的芽体。置于组培室中，在 25 ℃ 下光照培养约20 d，定期观察并记录。
1.2.3 根的生长 配制生根培养基时，分别加入浓度为60、80、100、120 mg/L的Kan，同一浓度至少配制6瓶培养基。将非洲紫罗兰的不定芽接种至不同Kan浓度的生根培养基中，各瓶接种相同数量的芽体。置于组培室中，在25 ℃下光照培养约20 d，定期观察并记录。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织诱导阶段Kan浓度的筛选
Kan浓度为20（图1-A）、40 mg/L（图1-B）时非洲紫罗兰外植体颜色较绿；Kan浓度为60 mg/L（图1-C）时外植体发黄；Kan浓度为80（图1-D）、100 mg/L（图1-E）时外植[CM（25]体失绿褐化。可见，愈伤组织诱导阶段的Kan浓度为
[FK（W17][TPGHY1.tif]
60 mg/L 时，愈伤组织的诱导受到抑制。
2.2 芽分化阶段Kan浓度的筛选
在Kan浓度为20（图2-A）、40（图2-B）、60 mg/L（图2-C）的芽增殖培养基中，外植体生长良好，叶片颜色较绿；Kan浓度为80（图2-D）、100 mg/L（图2-E）时芽体枯黄，失去芽增殖能力。可见，芽分化阶段的Kan浓度为 80 mg/L 时，芽的分化受到抑制。
[FK（W17][TPGHY2.tif]
2.3 生根阶段Kan浓度的筛选
在Kan浓度为60（图3-A）、80 mg/L（图3-B）的生根培养基中，植株可正常生根；Kan浓度为100 mg/L（图3-C）时，仅部分植株能够生根，其余植株无根生长；Kan浓度为120 mg/L（图3-D）时，植株的生根完全被抑制。可见，生根阶段的Kan浓度为120 mg/L时，植株完全丧失生根能力，后续试验可用此浓度筛选去除转基因阴性株系。 3 结论与讨论
本试验利用组织培养的方法，将非洲紫罗兰的外植体接
种于不同Kan浓度的培养基中进行培养。结果表明，在愈伤组织诱导阶段，Kan浓度为60 mg/L时外植体的愈伤诱导受到抑制；在芽的分化阶段，Kan浓度为80 mg/L时芽的增殖受到抑制；在生根阶段，Kan浓度为120 mg/L时根的生长受到抑制。
在植物转化过程中，必须通过筛选才能获得转基因成功的植株，将卡那霉素作为一种筛选剂加入选择培养基中，以便对转化植株进行筛选。卡那霉素浓度的高低直接影响转化细胞的生长 [11]。不同植物、同一植物不同外植体对卡那霉素的敏感性均可能存在差异，因此筛选浓度各不相同。转化前应设置不同的卡那霉素浓度梯度，找到植物最为敏感的卡那霉素浓度，以便在适当条件下有效抑制非转化细胞的生长并使其缓慢死亡，从而准确筛选出转基因阳性株系。
参考文献：
[1] 陈光中. 安全性的争议[J]. 预防医学杂志，2001，3（9）：405-406.
[2]杜建中，孙 毅，王景雪，等. 转基因玉米中目的基因的遗传表达及其抗病性研究[J]. 西北植物学报，2007，27（9）：1720-1727.
[3]李剑芳，邬敏辰，王 琴. 基因食品机器安全性研究进展[J]. 江苏食品与发酵，2003（3）：8-12.
[4]Wang G L，Fang H J. Plant genetic engineering[M]. 2nd ed.Beijing：Sience Press，2002：527-606.
[5]姚春馨，许明辉，李进斌，等. 转几丁质酶-葡聚糖酶双价基因水稻稻米毒理试验[J]. 中国粮油学报，2007，22（4）：18-23.
[6]赵 爽，雷建军，陈国菊，等. 卡那霉素在转基因芥菜中的应用[J]. 遗传，2008，30（4）：501-507.
[7]欧阳波，龙 芳，张扬勇，等. 利用转基因标记NPT[QX（Y15]Ⅱ[QX）]快速、规模化纯合转基因番茄[J]. 武汉植物学研究，2006，24（1）：12-16.
[8]景 岚，孙燕飞，张 岗，等. 油菜遗传转化体系中卡那霉素浓度的筛选及抑菌剂的选择[J]. 西北农业学报，2008，17（1）：102-105.
[9]裴仁济，陈小强，孙 宁，等. 花色模式植物——非洲紫罗兰[J]. 北方园艺，2010（11）：219-222.
[10] 陆 帅，董永辉，陈 佳. 非洲紫罗兰形态特征及繁殖技术[J]. 现代农村科技，2009，43（6）：39.
[11]王关林，方宏筠. 植物基因工程[M]. 北京：科学出版社，2009：527-528.
关键词： 卡那霉素；抗性筛选；非洲紫罗兰
中图分类号： S681.204 .3 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0056-02
自1983年成功获得转基因烟草以来 [1]，关于转基因的研究越来越多，世界转基因市场总收入超过30 000亿美元，仅转基因植物种子的收入可达3 000亿美元 [2]。目前已成功获得200多种转基因植物，3 000多例转基因植物已进入大田试验阶段 [3]。在植物的转基因研究中，npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因常被作为选择标记基因，该基因编码氨基糖苷-3′-磷酸转移酶（aminnoglycoside-3′-phosphotransferase）Ⅱ，又称npt-Ⅱ（neomycin phosphotransferaseⅡ），该酶使氨基糖苷类抗生素（卡那霉素、新霉素、巴龙霉素G418等）磷酸化而失活 [4]；因此，npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因可用作遗传转化过程中区分转基因、非转基因植物细胞的标记 [5]。卡那霉素（kanamycin，Kan）影响线粒体和叶绿体的核糖体70S起始复合物生成，使蛋白质合成受阻，最终导致细胞死亡 [6]。根据其特性，对以npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因为选择标记基因的转基因后代株系进行筛选，后代发生分离，含目的基因的株系一定携带npt-[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因，对卡那霉素处理不敏感；不含目的基因的植株不具有卡那霉素抗性，对卡那霉素处理敏感。目前，利用Kan对转基因株系进行筛选已经应用于水稻、小麦、棉花、番茄等作物 [7]。不同植物、不同类型的外植体应使用不同浓度的卡那霉素，使其有效抑制未转化成功的细胞生长并使之缓慢死亡，又不影响转化成功的细胞正常生长。抗生素浓度过低虽不影响转化株的正常生长，但可能出现嵌合体和假阳性现象；抗生素浓度过高则毒性过强，会快速杀死细胞，而死细胞对邻近活细胞常有较强的抑制作用，不利于转化细胞的生长 [8]。非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha）为非洲苦苣苔科多年生草本植物，原产于非洲坦桑尼亚海拔700～1 000 m [JP3]的乌桑巴拉山，是一种观赏价值较高的室内盆栽花卉，被誉为“室内花卉皇后” [9-10]。植物基因工程不仅广泛应用于农作物的改良，也是花卉改良的主要手段，[JP2]本试验确定了非洲紫罗兰组培体系中的卡那霉素抗性筛选浓度，为进一步的转基因研究提供依据，并为花卉品种的改良提供全新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
非洲紫罗兰组培苗（组培室培养）、卡那霉素、6-BA、NAA。生芽培养基配方为：MS、0.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA。生根培养基配方为：1/2MS、0.01 mg/L NAA。
1.2 方法
1.2.1 愈伤组织的诱导 配制诱导愈伤组织的培养基时，分别加入浓度为20、40、60、80、100 mg/L的Kan，同一浓度至少配制6瓶培养基。挑选生命力强的组培苗叶片，将其切成小方块并接种至不同Kan浓度的培养基中，各瓶接种相同数量的外植体。置于组培室中，在25 ℃下光照培养约20 d，定期观察并记录。
1.2.2 芽的分化 配制芽分化培养基时，分别加入浓度为20、40、60、80、100 mg/L的Kan，同一浓度至少配制6瓶培养基。将非洲紫罗兰的不定芽接种至不同Kan浓度的芽增殖培养基中，各瓶接种相同数量的芽体。置于组培室中，在 25 ℃ 下光照培养约20 d，定期观察并记录。
1.2.3 根的生长 配制生根培养基时，分别加入浓度为60、80、100、120 mg/L的Kan，同一浓度至少配制6瓶培养基。将非洲紫罗兰的不定芽接种至不同Kan浓度的生根培养基中，各瓶接种相同数量的芽体。置于组培室中，在25 ℃下光照培养约20 d，定期观察并记录。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织诱导阶段Kan浓度的筛选
Kan浓度为20（图1-A）、40 mg/L（图1-B）时非洲紫罗兰外植体颜色较绿；Kan浓度为60 mg/L（图1-C）时外植体发黄；Kan浓度为80（图1-D）、100 mg/L（图1-E）时外植[CM（25]体失绿褐化。可见，愈伤组织诱导阶段的Kan浓度为
[FK（W17][TPGHY1.tif]
60 mg/L 时，愈伤组织的诱导受到抑制。
2.2 芽分化阶段Kan浓度的筛选
在Kan浓度为20（图2-A）、40（图2-B）、60 mg/L（图2-C）的芽增殖培养基中，外植体生长良好，叶片颜色较绿；Kan浓度为80（图2-D）、100 mg/L（图2-E）时芽体枯黄，失去芽增殖能力。可见，芽分化阶段的Kan浓度为 80 mg/L 时，芽的分化受到抑制。
[FK（W17][TPGHY2.tif]
2.3 生根阶段Kan浓度的筛选
在Kan浓度为60（图3-A）、80 mg/L（图3-B）的生根培养基中，植株可正常生根；Kan浓度为100 mg/L（图3-C）时，仅部分植株能够生根，其余植株无根生长；Kan浓度为120 mg/L（图3-D）时，植株的生根完全被抑制。可见，生根阶段的Kan浓度为120 mg/L时，植株完全丧失生根能力，后续试验可用此浓度筛选去除转基因阴性株系。 3 结论与讨论
本试验利用组织培养的方法，将非洲紫罗兰的外植体接
种于不同Kan浓度的培养基中进行培养。结果表明，在愈伤组织诱导阶段，Kan浓度为60 mg/L时外植体的愈伤诱导受到抑制；在芽的分化阶段，Kan浓度为80 mg/L时芽的增殖受到抑制；在生根阶段，Kan浓度为120 mg/L时根的生长受到抑制。
在植物转化过程中，必须通过筛选才能获得转基因成功的植株，将卡那霉素作为一种筛选剂加入选择培养基中，以便对转化植株进行筛选。卡那霉素浓度的高低直接影响转化细胞的生长 [11]。不同植物、同一植物不同外植体对卡那霉素的敏感性均可能存在差异，因此筛选浓度各不相同。转化前应设置不同的卡那霉素浓度梯度，找到植物最为敏感的卡那霉素浓度，以便在适当条件下有效抑制非转化细胞的生长并使其缓慢死亡，从而准确筛选出转基因阳性株系。
参考文献：
[1] 陈光中. 安全性的争议[J]. 预防医学杂志，2001，3（9）：405-406.
[2]杜建中，孙 毅，王景雪，等. 转基因玉米中目的基因的遗传表达及其抗病性研究[J]. 西北植物学报，2007，27（9）：1720-1727.
[3]李剑芳，邬敏辰，王 琴. 基因食品机器安全性研究进展[J]. 江苏食品与发酵，2003（3）：8-12.
[4]Wang G L，Fang H J. Plant genetic engineering[M]. 2nd ed.Beijing：Sience Press，2002：527-606.
[5]姚春馨，许明辉，李进斌，等. 转几丁质酶-葡聚糖酶双价基因水稻稻米毒理试验[J]. 中国粮油学报，2007，22（4）：18-23.
[6]赵 爽，雷建军，陈国菊，等. 卡那霉素在转基因芥菜中的应用[J]. 遗传，2008，30（4）：501-507.
[7]欧阳波，龙 芳，张扬勇，等. 利用转基因标记NPT[QX（Y15]Ⅱ[QX）]快速、规模化纯合转基因番茄[J]. 武汉植物学研究，2006，24（1）：12-16.
[8]景 岚，孙燕飞，张 岗，等. 油菜遗传转化体系中卡那霉素浓度的筛选及抑菌剂的选择[J]. 西北农业学报，2008，17（1）：102-105.
[9]裴仁济，陈小强，孙 宁，等. 花色模式植物——非洲紫罗兰[J]. 北方园艺，2010（11）：219-222.
[10] 陆 帅，董永辉，陈 佳. 非洲紫罗兰形态特征及繁殖技术[J]. 现代农村科技，2009，43（6）：39.
[11]王关林，方宏筠. 植物基因工程[M]. 北京：科学出版社，2009：527-528.