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摘要：以单因素试验、正交试验、验证性试验设计为基本研究方法，以杏鲍菇多糖提取率为评价指标，确定2种辅助方法提取杏鲍菇多糖的优组合条件及2种优组合的比较。结果表明，微波辅助提取多糖的优组合是微波功率为500 W，浸提时间6 min，料液比1 g ∶30 mL，浸提次数为5次，多糖提取率为3.64%。恒温水浴振荡辅助提取多糖的优组合是速度为225 r/min，浸提时间100 min，料液比1 g∶30 mL，浸提次数为4次，浸提温度65 ℃，多糖提取率为346%。结果微波辅助法优于水浴振荡辅助法，2者杏鲍菇多糖得率差异显著。
关键词：杏鲍菇多糖；微波；恒温水浴振荡；提取；比较研究
中图分类号： TS201.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0259-04
收稿日期：2014-04-21
作者简介：朱月（1958—），女，辽宁黑山人，教授，现从事生物化学教学和食用菌多糖研究。E.mail：cfzy212@126.com。杏鲍菇[PLeurothus eryngii（DC.：Fr.）Quel]，别称刺芹侧耳，属口蘑科侧耳属[1]。现代药理学研究表明，杏鲍菇中所含的多糖能增强机体免疫，具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降低机体胆固醇含量、防止动脉硬化等作用[2-3]。筛选杏鲍菇多糖提取的最佳方法，提高多糖提取率，对于杏鲍菇多糖的有效利用与开发，提高其经济价值、保健价值和药用价值具有十分重要的意义。水浴振荡及微波辅助提取杏鲍菇多糖技术[4-5]已有报道，但关于2种辅助法提取杏鲍菇多糖的比较研究目前还未见报道。本试验通过对水浴振荡辅助法与微波辅助法提取杏鲍菇多糖技术的比较研究，进一步优选杏鲍菇多糖提取技术，提高杏鲍菇多糖的产率，为杏鲍菇资源的开发和利用提供技术手段。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1材料与试剂市售新鲜的杏鲍菇。浓硫酸、苯酚、无水乙醇、葡萄糖，以上试剂均为分析纯。
1.1.2仪器与设备电热鼓风干燥箱（CS101-AB型）；分光光度计（UV-9600）；恒温水浴振荡器（国华SHA—）；试验专用微波炉（NJL07-3型）；电子天平（PL203）；离心机（DD-5M）；500～5 000 μL（Eppendorf Research）移液枪等。
1.2方法
1.2.1材料预处理将新鲜杏鲍菇用清水洗净沥干，烘干粉碎，过100目筛，收集粉末干燥至恒质量，备用。
1.2.2葡萄糖标准曲线的制作采用苯酚-硫酸法测定不同标准葡萄糖浓度下的吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，采用Excel制作葡萄糖标准曲线[6]，求出多糖含量的直线方程。
1.2.3最适辅助条件的确定设定浸提条件为试验的固定因素，微波功率、水浴振荡速度为试验的可变因素，以多糖提取率为评价指标，通过单因素试验和统计学分析，确定杏鲍菇粗多糖提取的最适微波功率和最适水浴振荡速度。
1.2.4最适辅助条件下粗多糖提取条件水平的确定分别以试验确定的最适辅助条件为固定因素，以设定的浸提条件中的任一条件为可变因素，其他浸提条件为固定因素进行单因素试验。每个单因素试验重复3组。以多糖提取率为评价指标，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析或Kruskal-Wallis 检验，分别比较相同浸提条件不同水平对多糖提取的影响程度，确定单因素水平。
1.2.52种辅助方法的优选及比较分别在最适辅助条件下，依试验所确定的单因素水平进行正交设计和试验。采用Excel和SPSS 17.0软件进行统计学分析[7]，确定2种辅助方法提取杏鲍菇多糖的优组合浸提条件并比较差异程度。
1.2.6验证性试验采用正交试验确定的提取杏鲍菇多糖的优组合浸提条件进行验证性试验（试验重复3次），所得的多糖产率与正交试验各组所得的多糖产率进行比较，判断优组合条件的可靠性、可重复性和稳定性。采用t检验和单因素方差分析的统计学方法对2种辅助方法进行比较分析。
2结果与分析
2.1葡萄糖标准曲线及杏鲍菇多糖提取率计算方法
葡萄糖标准曲线回归方程y=0.006 2x 0.004 5。相关系数r=0.997 6。说明葡萄糖浓度在30～150 μg/mL范围内，葡萄糖浓度与吸光度呈线性关系（图1）。
根据回归方程及试验的相关操作，杏鲍菇多糖提取率计算方法如下：多糖提取液多糖质量浓度（μg/mL）=（D值-0.004 5）/0.006 2；多糖提取率=（多糖质量浓度×多糖提取液总体积）/杏鲍菇干粉质量×100%。
2.2杏鲍菇多糖辅助条件优选结果
在其他浸提条件不变的条件下，杏鲍菇多糖的提取率随着微波功率的提高而呈现上升趋势，当微波功率达到该微波
炉可调功率500 W左右时达到最大值（图2）。因此，选择500 W为微波辅助提取杏鲍菇多糖的微波功率。随着水浴振荡速度的增加，多糖提取率呈上升趋势，且振荡速度在 225 r/min 左右时达到最大值（图3）。因此，确定225 r/min为水浴振荡辅助提取杏鲍菇多糖的最佳振荡速度。
2.3杏鲍菇多糖提取条件水平的确定
2.3.1最适微波功率下提取因素水平的确定在最适微波功率条件下不同浸提时间、料液比、浸提次数对杏鲍菇多糖提取均产生影响（图4、图5、图6）。Kruskal-Wallis 检验[8]结果显示，浸提时间、料液比对杏鲍菇多糖提取影响显著。单因素方差分析结果[9]显示，浸提次数对杏鲍菇多糖提取影响极显著。综合以上分析结果，确定最适微波辅助条件下浸提杏鲍菇多糖的因素水平（表1）。
2.3.2最适水浴振荡速度下提取因素水平的确定在最适水浴振荡速度条件下不同的浸提时间，浸提次数、料液比、浸提温度对杏鲍菇多糖提取率均产生影响（图7、图8、图9、图10）。单因素方差分析结果显示，不同的浸提时间、不同的温度、不同的浸提次数对杏鲍菇多糖提取率的影响极显著。所设定的料液比对杏鲍菇多糖提取虽然有影响，但影响不显著。 综合以上分析结果，确定最适水浴振荡辅助条件下浸提杏鲍菇多糖的因素水平（表2）。
2.4不同辅助条件下提取杏鲍菇多糖的最适条件
2.4.1微波辅助提取杏鲍菇多糖最适条件的确定根据表1设计的3因素3水平，采用L9（34）正交试验表，以杏鲍菇多糖产率为评价指标，进行正交试验。极差分析结果见表2。正交试验方差分析结果见表3。
2.4.2水浴振荡辅助提取杏鲍菇多糖最佳条件的确定根据表4确定的4因素3水平，采用L9（34）正交表，以多糖提取率为指标，进行正交试验。极差分析结果见表5，方差分析见表6。表5极差分析结果显示，4因素在不同水平条件下对多糖提取均产生影响，影响的主次关系从大至小依次为浸提温度、浸提时间、浸提次数和浸提料液比。在水浴振荡为 225 r/min 条件下，浸提温度65 ℃、浸提4次、料液比 1 g ∶30 mL、浸提100 min为浸提的最佳组合。表6结果显示，4因素中除料液比外，其他3因素对多糖提取均有极显著影响。
2.5验证性试验
称取1.00 g的杏鲍菇干粉3份，在微波功率为500 W的辅助条件下，以1 g ∶30 mL的料液比浸提6 min、浸提5次。结果杏鲍菇多糖的提取率为3.64%，高于正交试验中的任何一组。
称取1.00 g杏鲍菇干粉3 份，在水浴振荡速度为 225 r/min 的辅助条件下，在65 ℃的温度下，以1 g ∶30 mL的料液比浸提100 min、浸提4次，结果杏鲍菇多糖的提取率为346%，高于正交试验中的任何一组。
统计分析结果，2种辅助方法提取杏鲍菇多糖的得率差异显著（表7），微波辅助法杏鲍菇多糖得率高于水浴振荡辅助法。
3结论与讨论
本研究以杏鲍菇多糖提取率为评价指标，在单因素试验的基础上，筛选和确定微波辅助法和水浴振荡辅助法提取杏鲍菇多糖的最适辅助条件，并在最适辅助条件下，确定影响提取杏鲍菇多糖的因素水平，通过正交试验和统计分析确定2种辅助方法在最适辅助条件下提取条件的优组合，并对2种优组合进行验证性试验及比较。研究结果表明，500 W的微波功率、225 r/min的水浴振荡速度是提取杏鲍菇多糖比较适宜的辅助条件；不同的浸提时间、浸提温度、浸提次数、料液比对其多糖的提取也产生不同程度的影响。在微波功率为 500 W 的辅助条件下，浸提条件优组合是浸提时间6 min、料液比1 g ∶30 mL、浸提5次，杏鲍菇多糖提取率为3.64%；在水浴振荡速度为225 r/min的辅助条件下，浸提条件的优组合是浸提时间100 min、料液比1 g ∶30 mL、浸提4次、浸提温度65 ℃，杏鲍菇多糖提取率为3.46%。优组合浸提条件下多糖得率均高于正交试验各试验组的得率，优选的浸提条件具有可重复性，方法可靠、稳定。微波辅助法提取杏鲍菇多糖优于水浴振荡辅助提取法，2者杏鲍菇多糖得率差异显著。
本试验证明微波辅助法优于水浴振荡法，原因是微波萃取技术可穿透萃取介质，直接作用于物质内部，使杏鲍菇多糖从原料内部向外部扩散的速度加快，增大目标物质在介质中的溶解度，增强传质驱动力，加速目标物质由原料内部向界面层扩散，从而使萃取速率提高数倍[10]，区别于水浴振荡法的外部振荡原理[11]。与水浴振荡辅助法提取多糖相比，微波辅助法提取多糖可在浸提时间较短的前提下获取相对较高的多糖提取率。
参考文献：
[1]卯晓岚. 中国大型真菌[M]. 郑州：河南科学技术出版社，2000：64.
[2]迟桂荣，徐琳，吴继卫，等. 杏鲍菇多糖的抗病毒、抗肿瘤研究[J]. 莱阳农学院学报，2006，23（3）：174-176.
[3]张俊会，王谦. 杏鲍菇多糖的抗氧化活性研究[J]. 中国食用菌，2003，22（2）：38-39.
[4]朱月，段蕊晔，毕晓丹. 杏鲍菇多糖提取条件研究[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：276-278.
[5]杜敏华，田龙. 微波辅助法提取杏鲍菇多糖研究[J]. 食品科技，2007，32（3）：117-119.
[6]陈静静，江波，张涛，等. 银杏外种皮多糖的提取和纯化工艺研究[J]. 食品工业科技，2011，32（7）：242-245.
[7]刘加妹，周志坚. 利用SPSS处理生物实验数据[J]. 生殖医学杂志，2008，17（2）：130-134.
[8]张静. 非参数单因子方差分析[J]. 数学教学研究，2010，29（9）：61-62，65.
[9]黄创绵，蔡汝山. 单因素方差分析方法在环境试验中的应用[J]. 电子产品可靠性与环境试验，2010，28（6）：21-26.
[10]张彩文. 微波萃取在天然产物化学成分提取中的应用研究[J]. 周口师范学院学报，2008，25（5）：76-80.
[11]邹伟，张宝善，李冰，等. 水浴振荡辅助酶法提取双孢蘑菇多糖的工艺研究[J]. 食品工业科技，2011，32（5）：223-224，334.杨晓亮，宋朝鹏，张铭真，等. 延长变黄和定色末期时间对烤烟上部叶质量的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：263-266.
关键词：杏鲍菇多糖；微波；恒温水浴振荡；提取；比较研究
中图分类号： TS201.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0259-04
收稿日期：2014-04-21
作者简介：朱月（1958—），女，辽宁黑山人，教授，现从事生物化学教学和食用菌多糖研究。E.mail：cfzy212@126.com。杏鲍菇[PLeurothus eryngii（DC.：Fr.）Quel]，别称刺芹侧耳，属口蘑科侧耳属[1]。现代药理学研究表明，杏鲍菇中所含的多糖能增强机体免疫，具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降低机体胆固醇含量、防止动脉硬化等作用[2-3]。筛选杏鲍菇多糖提取的最佳方法，提高多糖提取率，对于杏鲍菇多糖的有效利用与开发，提高其经济价值、保健价值和药用价值具有十分重要的意义。水浴振荡及微波辅助提取杏鲍菇多糖技术[4-5]已有报道，但关于2种辅助法提取杏鲍菇多糖的比较研究目前还未见报道。本试验通过对水浴振荡辅助法与微波辅助法提取杏鲍菇多糖技术的比较研究，进一步优选杏鲍菇多糖提取技术，提高杏鲍菇多糖的产率，为杏鲍菇资源的开发和利用提供技术手段。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1材料与试剂市售新鲜的杏鲍菇。浓硫酸、苯酚、无水乙醇、葡萄糖，以上试剂均为分析纯。
1.1.2仪器与设备电热鼓风干燥箱（CS101-AB型）；分光光度计（UV-9600）；恒温水浴振荡器（国华SHA—）；试验专用微波炉（NJL07-3型）；电子天平（PL203）；离心机（DD-5M）；500～5 000 μL（Eppendorf Research）移液枪等。
1.2方法
1.2.1材料预处理将新鲜杏鲍菇用清水洗净沥干，烘干粉碎，过100目筛，收集粉末干燥至恒质量，备用。
1.2.2葡萄糖标准曲线的制作采用苯酚-硫酸法测定不同标准葡萄糖浓度下的吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，采用Excel制作葡萄糖标准曲线[6]，求出多糖含量的直线方程。
1.2.3最适辅助条件的确定设定浸提条件为试验的固定因素，微波功率、水浴振荡速度为试验的可变因素，以多糖提取率为评价指标，通过单因素试验和统计学分析，确定杏鲍菇粗多糖提取的最适微波功率和最适水浴振荡速度。
1.2.4最适辅助条件下粗多糖提取条件水平的确定分别以试验确定的最适辅助条件为固定因素，以设定的浸提条件中的任一条件为可变因素，其他浸提条件为固定因素进行单因素试验。每个单因素试验重复3组。以多糖提取率为评价指标，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析或Kruskal-Wallis 检验，分别比较相同浸提条件不同水平对多糖提取的影响程度，确定单因素水平。
1.2.52种辅助方法的优选及比较分别在最适辅助条件下，依试验所确定的单因素水平进行正交设计和试验。采用Excel和SPSS 17.0软件进行统计学分析[7]，确定2种辅助方法提取杏鲍菇多糖的优组合浸提条件并比较差异程度。
1.2.6验证性试验采用正交试验确定的提取杏鲍菇多糖的优组合浸提条件进行验证性试验（试验重复3次），所得的多糖产率与正交试验各组所得的多糖产率进行比较，判断优组合条件的可靠性、可重复性和稳定性。采用t检验和单因素方差分析的统计学方法对2种辅助方法进行比较分析。
2结果与分析
2.1葡萄糖标准曲线及杏鲍菇多糖提取率计算方法
葡萄糖标准曲线回归方程y=0.006 2x 0.004 5。相关系数r=0.997 6。说明葡萄糖浓度在30～150 μg/mL范围内，葡萄糖浓度与吸光度呈线性关系（图1）。
根据回归方程及试验的相关操作，杏鲍菇多糖提取率计算方法如下：多糖提取液多糖质量浓度（μg/mL）=（D值-0.004 5）/0.006 2；多糖提取率=（多糖质量浓度×多糖提取液总体积）/杏鲍菇干粉质量×100%。
2.2杏鲍菇多糖辅助条件优选结果
在其他浸提条件不变的条件下，杏鲍菇多糖的提取率随着微波功率的提高而呈现上升趋势，当微波功率达到该微波
炉可调功率500 W左右时达到最大值（图2）。因此，选择500 W为微波辅助提取杏鲍菇多糖的微波功率。随着水浴振荡速度的增加，多糖提取率呈上升趋势，且振荡速度在 225 r/min 左右时达到最大值（图3）。因此，确定225 r/min为水浴振荡辅助提取杏鲍菇多糖的最佳振荡速度。
2.3杏鲍菇多糖提取条件水平的确定
2.3.1最适微波功率下提取因素水平的确定在最适微波功率条件下不同浸提时间、料液比、浸提次数对杏鲍菇多糖提取均产生影响（图4、图5、图6）。Kruskal-Wallis 检验[8]结果显示，浸提时间、料液比对杏鲍菇多糖提取影响显著。单因素方差分析结果[9]显示，浸提次数对杏鲍菇多糖提取影响极显著。综合以上分析结果，确定最适微波辅助条件下浸提杏鲍菇多糖的因素水平（表1）。
2.3.2最适水浴振荡速度下提取因素水平的确定在最适水浴振荡速度条件下不同的浸提时间，浸提次数、料液比、浸提温度对杏鲍菇多糖提取率均产生影响（图7、图8、图9、图10）。单因素方差分析结果显示，不同的浸提时间、不同的温度、不同的浸提次数对杏鲍菇多糖提取率的影响极显著。所设定的料液比对杏鲍菇多糖提取虽然有影响，但影响不显著。 综合以上分析结果，确定最适水浴振荡辅助条件下浸提杏鲍菇多糖的因素水平（表2）。
2.4不同辅助条件下提取杏鲍菇多糖的最适条件
2.4.1微波辅助提取杏鲍菇多糖最适条件的确定根据表1设计的3因素3水平，采用L9（34）正交试验表，以杏鲍菇多糖产率为评价指标，进行正交试验。极差分析结果见表2。正交试验方差分析结果见表3。
2.4.2水浴振荡辅助提取杏鲍菇多糖最佳条件的确定根据表4确定的4因素3水平，采用L9（34）正交表，以多糖提取率为指标，进行正交试验。极差分析结果见表5，方差分析见表6。表5极差分析结果显示，4因素在不同水平条件下对多糖提取均产生影响，影响的主次关系从大至小依次为浸提温度、浸提时间、浸提次数和浸提料液比。在水浴振荡为 225 r/min 条件下，浸提温度65 ℃、浸提4次、料液比 1 g ∶30 mL、浸提100 min为浸提的最佳组合。表6结果显示，4因素中除料液比外，其他3因素对多糖提取均有极显著影响。
2.5验证性试验
称取1.00 g的杏鲍菇干粉3份，在微波功率为500 W的辅助条件下，以1 g ∶30 mL的料液比浸提6 min、浸提5次。结果杏鲍菇多糖的提取率为3.64%，高于正交试验中的任何一组。
称取1.00 g杏鲍菇干粉3 份，在水浴振荡速度为 225 r/min 的辅助条件下，在65 ℃的温度下，以1 g ∶30 mL的料液比浸提100 min、浸提4次，结果杏鲍菇多糖的提取率为346%，高于正交试验中的任何一组。
统计分析结果，2种辅助方法提取杏鲍菇多糖的得率差异显著（表7），微波辅助法杏鲍菇多糖得率高于水浴振荡辅助法。
3结论与讨论
本研究以杏鲍菇多糖提取率为评价指标，在单因素试验的基础上，筛选和确定微波辅助法和水浴振荡辅助法提取杏鲍菇多糖的最适辅助条件，并在最适辅助条件下，确定影响提取杏鲍菇多糖的因素水平，通过正交试验和统计分析确定2种辅助方法在最适辅助条件下提取条件的优组合，并对2种优组合进行验证性试验及比较。研究结果表明，500 W的微波功率、225 r/min的水浴振荡速度是提取杏鲍菇多糖比较适宜的辅助条件；不同的浸提时间、浸提温度、浸提次数、料液比对其多糖的提取也产生不同程度的影响。在微波功率为 500 W 的辅助条件下，浸提条件优组合是浸提时间6 min、料液比1 g ∶30 mL、浸提5次，杏鲍菇多糖提取率为3.64%；在水浴振荡速度为225 r/min的辅助条件下，浸提条件的优组合是浸提时间100 min、料液比1 g ∶30 mL、浸提4次、浸提温度65 ℃，杏鲍菇多糖提取率为3.46%。优组合浸提条件下多糖得率均高于正交试验各试验组的得率，优选的浸提条件具有可重复性，方法可靠、稳定。微波辅助法提取杏鲍菇多糖优于水浴振荡辅助提取法，2者杏鲍菇多糖得率差异显著。
本试验证明微波辅助法优于水浴振荡法，原因是微波萃取技术可穿透萃取介质，直接作用于物质内部，使杏鲍菇多糖从原料内部向外部扩散的速度加快，增大目标物质在介质中的溶解度，增强传质驱动力，加速目标物质由原料内部向界面层扩散，从而使萃取速率提高数倍[10]，区别于水浴振荡法的外部振荡原理[11]。与水浴振荡辅助法提取多糖相比，微波辅助法提取多糖可在浸提时间较短的前提下获取相对较高的多糖提取率。
参考文献：
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[8]张静. 非参数单因子方差分析[J]. 数学教学研究，2010，29（9）：61-62，65.
[9]黄创绵，蔡汝山. 单因素方差分析方法在环境试验中的应用[J]. 电子产品可靠性与环境试验，2010，28（6）：21-26.
[10]张彩文. 微波萃取在天然产物化学成分提取中的应用研究[J]. 周口师范学院学报，2008，25（5）：76-80.
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