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目的:通过对贵州省某三甲医院临床分离的37株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)进行耐药基因型、耐药表型检测以及同源性分析,为预防和控制CRKP的感染和暴发流行及指导临床合理用药提供实验依据。方法:1.以贵州省某三甲医院2016年3月-2017年2月从患者痰液、血液、中段尿和腹水中分离的对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌株为研究对象,在Phoenixtm-100全自动微生物分析系统检测进行细菌鉴定后,参照美国临床和微生物标准化实验室(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)应用改良Hodge试验进行表型验证,并应用EDTA-亚胺培南双纸片协同试验对CRKP菌株产金属β-内酰胺酶进行筛查。2.根据CLSI推荐的微量肉汤稀释法检测细菌对13种抗生素的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),分析其耐药谱。3.利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术检测常见的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌耐药基因(包括KPC-2、GES、IMP、VIM、NDM-1、OXA-48),扩增产物双向测序后与GenBank数据库进行比对,确定CRKP菌株携带的耐药基因型。4.利用PCR技术扩增CRKP菌株的7个管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB),进行多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)。5.利用MEGA软件对菌株进行进化树构建,并通过eBURST3.0软件对MLST结果进行CRKP种群结构分析。6.分析携带NDM-1+KPC-2基因的菌株感染者临床资料,对ST11组与非ST11组患者的临床资料进行比较。利用SPSS17.0对所得到数据进行分析,年龄、住院时间等连续变量的组间比较采用t检验及非参数检验(Mann-Whiteney U法),其他分类变量项目的组间比较采用Fisher确切概率法检验(P<0.05表示差异有统计学意义)。结果:1.共收集贵州省某三甲医院临床分离的CRKP菌株50株,改良Hodge实验表型验证后,37株受试菌纳入研究。2.37株CRKP中有3株细菌金属酶检测结果阳性,阳性率为10.8%。3.微量肉汤稀释法结果显示:37株CRKP对碳青霉烯类药物(亚胺培南、美罗培南)呈现不同程度耐药,范围在4~>256μg/ml。对于氨基糖苷类的庆大霉素、3代头孢菌素头孢曲松、以及临床上常用的抗生素联合β-内酰胺酶抑制剂均出现高水平耐药,而对于阿米卡星,耐药率较低,为81.1%,耐药范围在1~>256μg/ml;对于阿奇霉素、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦,耐药率均为97.3%。4.在37株CRKP中共检出2种耐药基因,分别是KPC-2基因检出率为100%,其次有3株同时携带NDM-1基因,37株细菌均未检出OXA-48,GES,IMP,VIM基因。5.MLST及分子遗传学结果分析显示37株CRKP菌株分为8个ST型,以ST11(25/37,67.6%)为主,其次为ST789(4/37,10.8%),ST524(2/37,5.4%);ST35、ST29、ST1066及ST244各1株。另外,ST2792(2/37,5.4%)为新ST型并被PubMlst数据库确认收录。6.种群结构分析提示8个ST型可分为5个克隆型(ST29,ST35,ST244,ST11,ST1066)和1个CC11克隆复合体(ST11、ST29、ST35、ST224、ST524、ST1066及ST2792),其中ST789为单个型。7.临床数据分析结果发现,ST11型组与非ST11型组在年龄、性别、感染途径、抗生素使用情况以及住院时间等项目上并没有统计学差异;同时携带KPC-2及NDM-1基因的菌株感染患者仅有3例,共同的临床表现主要为基础疾病更为严重,住院期间进行过侵入性操作和使用过多种抗生素联合治疗,而最终均死亡。结论:1.KPC-2是该三甲医院分离的CRKP中最流行的耐药基因型。2.ST11型为该医院CRKP最流行的克隆型,新发现的ST2972与其为同一克隆系。在同一区域不同时间可能存在相同基因型或克隆群的CRKP的流行,临床及相关检验科室需加强监测,避免耐药菌株的播散。3.细菌的克隆型并非影响其耐药性及预后等临床相关情况的重要因素。4.CRKP菌株耐药性强,耐药种类多,加强耐药菌株的监测刻不容缓。