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摘要[目的]比较不同品种及生育期玉米内生细菌的多样性差异，对分离到的内生细菌的拮抗作用进行鉴定。[方法]
以桂单0810、迪卡008、正大619玉米品种苗期和穗期的不同组织为研究对象，采用组织研磨匀浆方法分离培养内生细菌，结合形态生理特征和16S rDNA基因序列同源性比对分析对菌株进行了分类，并测定了所分离的菌株对4种玉米病原菌的拮抗作用。[結果]从桂单0810、迪卡008、正大619这3个玉米品种苗期和穗期的根、茎、叶中共分离到82株内生细菌，归于4个属，芽孢杆菌属为优势菌群，各菌群在不同生育期及组织的分布动态各有特点，其中有8株菌对4种玉米病原菌表现出不同程度的拮抗作用。[结论]玉米内生细菌的多样性丰富，可作为玉米病害生防菌的来源。
关键词玉米；内生细菌；动态分布；拮抗作用
中图分类号S182文献标识码A文章编号0517-6611（2016）30-0003-04
植物内生细菌是指能在健康植物组织内栖居且对植物不造成危害并建立和谐联合关系的细菌[1]。研究表明，内生细菌为植物微生态系统天然组成部分，其存在可提高植物对恶劣环境的适应性及促进寄主植物生长，还可作为潜在的内生拮抗细菌加以利用，减少化学农药造成的环境污染，提高农田生态系统的多样性，保持生态平衡[2]。植物内生细菌多样性和群落结构不仅因作物种类不同而存在差异[3]，还随着植物生长期、组织器官不同而有差别[4-5]。笔者以桂单0810、迪卡008、正大619这3个玉米品种苗期和穗期的不同组织为研究对象，采用组织研磨匀浆方法分离培养内生细菌，结合形态生理特征和16S rDNA基因序列同源性比对分析对菌株进行了分类，并测定了所分离的菌株对4种玉米病原菌的拮抗作用，旨在为玉米病害的生物防治提供参考。
1材料与方法
1.1材料玉米品种为桂单0810、迪卡008和正大619。细菌基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司产品；Taq PCR Mix为北京全式金生物技术有限公司产品；Gene JET为Thermo Scientific 公司产品。
1.2方法
1.2.1玉米种植与样本采集。将玉米品种桂单0810、迪卡008和正大619植于广西农业科学院明阳实验基地，随机区组排列，每个品种种植3个小区，每个小区5行，行长4.00 m，行距0.65 m，每行17株。于苗期和抽穗期进行样本采集，采用5点取样法，每点采4株。
1.2.2内生细菌的分离与纯化。
将样本用自来水冲洗干净，称取根、茎、叶各1.0 g，75%乙醇表面消毒1 min，0.1%氯化汞消毒根3 min、茎2 min、叶片1 min，无菌水冲洗3次后，加10 mL无菌水研磨至匀浆，吸取最后一次冲洗液（作为对照）和匀浆各1 mL稀释1 000倍，分别取1 mL稀释液置于培养皿，倒入营养琼脂（NA）固体培养基25 mL并混匀，28 ℃培养24～72 h。根据菌落的颜色和形态分类，计数，挑取菌落形态、色泽及培养基颜色等不同的菌株按常规方法纯化，纯化菌株转接入含有80%甘油的离心管中，4 ℃保存备用。
1.2.3细菌形态学鉴定。形态学鉴定包括菌落外形观察、革兰氏染色和显微镜观察[6]。
1.2.4细菌基因组DNA提取。
使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，操作按说明书进行，使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及其完整性，-40 ℃保存备用。
1.2.5细菌16S rDNA的PCR扩增与测序。采用通用引物对细菌16S rDNA片段进行PCR扩增，上游引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增体系为20 μL，其中含10 μL 2× Taq PCR Mix，2 μL DNA，4 μmol/L上、下游引物各1 μL，6 μL双蒸水。扩增程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36个循环；72 ℃延伸10 min。使用Gene JET胶回收试剂盒回收PCR，委托上海生工生物工程有限公司测序。
1.2.6序列生物信息分析。
将获得的16S rDNA序列与NCBI数据库中已知序列进行同源性比对，采用基因序列分析软件DNAMAN和系统发育树构建软件MEGA 7.0，与基因GenBank 数据库中相关属种基因序列进行系统发育树分析[7]。
1.2.7拮抗作用鉴定。
以玉米纹枯病、玉米大斑病、玉米小斑病和玉米茎腐病4种病原菌为供试病原菌，对分离到的内生细菌进行拮抗作用测试。采用平板对峙法，将已活化的直径5 mm的病原菌块接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板培养基中央，病原菌块四周等距离接入分离到的菌株，28 ℃培养7 d后测量病原菌向拮抗菌方向的生长距离，以仅接种病原菌块的平板为对照，计算抑菌率。
抑菌率=（对照病原菌菌落半径-病原菌向拮抗菌方向生长距离）/对照病原菌菌落半径×100%
2结果与分析
2.1内生细菌的分离数量及鉴定
从苗期各组织样本中分离获得内生细菌36株，从穗期样本中分离得到46株；从根中分离得到的菌株数量最多，为44株，茎中数量次之，为21株，叶中数量最少，为17株；从桂单0810获得的菌株数量最多，为36株，迪卡008次之，为28株（表1）。对获得的内生细菌进行形态学观察、生理生化反应和16S rDNA序列比对分析发现，82株内生细菌分属于芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）4个属（图1），其中芽孢杆菌属为优势类群，菌株数量为52株，占总数的63.4%（表1）。 2.2内生细菌类群的变化
随着生育期变化，植株内生细菌种类也有所变化。其中，桂单0810、迪卡008从苗期到穗期的内生细菌种类有所增加，桂单0810苗期未分离到假单胞菌属，但穗期阶段获得了假单胞菌属；迪卡008苗期只含有芽孢杆菌属
和肠杆菌属，穗期多分离到黄单胞菌属和假单胞菌属，正大619的内生细菌种类在不同生育期无变化（表2）。可见，不同品种的内生细菌种类变化情况存在差异。
2.3内生细菌数量的变化
分离计数发现，玉米植株内生细菌数量随着生育期发展呈上升趋势，其中桂单0810增幅最大，由苗期的1.983×104 cfu/g增长至穗期的12.307×104 cfu/g，增加了6.2倍。穗期各品种间的内生细菌总量差异达到显著水平，表明不同品种间内生细菌的富集能力存在差异，桂单0810较其他2个品种更易诱捕到内生细菌定殖繁
殖（表3）。
2.4拮抗作用鉴定
结果表明，82株内生细菌中，有8株对
4种病原菌表现出不同程度的拮抗作用，其中菌株GD16对4种病原菌均表现出不同程度的拮抗作用（表4）。
3结论与讨论
该研究结合形态学特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列比对分析法对分离到的82株细菌进行鉴定。结果表明，玉米内生细菌的多样性较丰富，共鉴定出芽孢杆菌属、肠杆菌属、黄单胞菌属、假单胞菌属4个属，以芽孢杆菌属为主，这与前人的分离结果一致[8]。
玉米内生细菌的种类、数量与品种的遗传背景及植株组织部位相关[5]。该研究表明，桂单0810和迪卡008均分离到4个属的内生细菌，而正大619只分离到3个属，其中桂单0810分离到的菌株数量最多，可能是该品种为当地选育品种，比较适应当地的生态环境和菌株的入侵。3个品种均表现为根组织中内生细菌的数量最大，茎和叶中数量次之，原因可能是由于根系统是内生细菌进入植物的入口，所以根聚集内生细菌比其他器官多[9]。在分离到的82株内生细菌中，有8株对玉米纹枯病菌等4种病原菌有拮抗作用，其中4株（GD08、GD16、ZD13、DK17）为芽孢杆菌属，1株（DK27）为假单胞菌属。芽孢杆菌在玉米中分布广、菌量大，在玉米植株过程中具有稳定的内生特性，并能够形成芽孢，抵抗外界不良环境，有些菌株对植物病害有较好的防治作用[10]。假单胞菌属是作物中具有稳定溶磷效应的优势菌种，分离自玉米的溶磷内生细菌，具有ACC脱氨酶活性，可以促进植株生长和防治植物病害[11]。并且假单胞菌能产生多种抗生素，改善植物营养，促进植物生长，并降解土壤中有毒物质，对植株促生及防病作用明显[12]。因此，该研究对3个玉米品种内生细菌的分离鉴定可为进一步研究细菌种属多样性与玉米品种特性的关系，并获得有益微生物资源奠定基础。
参考文献
[1]
HALLMANN J，QUDATHALLMANN A，MAHAFFEE W F，et al.Bacterial endophytes in agricultural crops[J].Can J Microbiol，1997，43（1）：895-914.
[2] COMPANT S，DUFFY B，NOWAK J，et al.Use of plant growthpromoting bacteria for biocontrol of plant diseases：Principles，mechanisms of action，and future prospects[J].Appl Environ Microbiol，2005，71（9）：4951-4959.
[3] YU Z H，YU J，LKENAGA M，et al.Characterizing endophytic bacterial diversity in roots of soybean and corn using locked nucleic acid （LNA） oligonucleotidePCR clamping and 454 pyrosequencing methods[J].J Integr Agr，2016，15：1883-1891.
[4] 刘洋，左山，鄒媛媛，等.杂交玉米农大108及其亲本种子内生细菌群落的多样性[J].中国农业科学，2011（23）：4763-4771.
[5] 高增贵，陈捷，刘限，等.玉米品种遗传多态性与根系内生细菌种群的相互关系[J].生态学报，2006（6）：1920-1925.
[6] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：365-375.
[7] KUMAR S，STECHER G，TAMURA K.MEGA7：Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J].Mol Biol Evol，2016，33（7）：1870-1874.
[8] 许艳蕊，方志军，卢晓平，等.四个玉米自交系根系内生细菌的分离和鉴定[J].作物杂志，2016（4）：112-117.
[9] 刘云霞，张青文，周明详.水稻体内细菌的动态研究[J].应用生态学报，1999（10）：735-738.
[10] 候美玲，辛媛媛，郝志敏，等.玉米内生芽胞杆菌的抗菌活性物质及其拮抗玉米大斑病菌机理的初步研究[J].农业生物技术学报，2012，20（9）：1018-1027.
[11] 沈萍，闫淑珍，陈双林，等.具ACC脱氨酶活性的植物内生细菌对辣椒的促生作用和对疫霉病的防治作用[J].植物保护学报，2008，35（1）：28-32.
[12] 滕松山，刘艳萍，赵蕾.具ACC脱氨酶活性的碱蓬内生细菌的分离、鉴定及其生物学特性[J].微生物学报，2010，50（11）：1503-1509.
以桂单0810、迪卡008、正大619玉米品种苗期和穗期的不同组织为研究对象，采用组织研磨匀浆方法分离培养内生细菌，结合形态生理特征和16S rDNA基因序列同源性比对分析对菌株进行了分类，并测定了所分离的菌株对4种玉米病原菌的拮抗作用。[結果]从桂单0810、迪卡008、正大619这3个玉米品种苗期和穗期的根、茎、叶中共分离到82株内生细菌，归于4个属，芽孢杆菌属为优势菌群，各菌群在不同生育期及组织的分布动态各有特点，其中有8株菌对4种玉米病原菌表现出不同程度的拮抗作用。[结论]玉米内生细菌的多样性丰富，可作为玉米病害生防菌的来源。
关键词玉米；内生细菌；动态分布；拮抗作用
中图分类号S182文献标识码A文章编号0517-6611（2016）30-0003-04
植物内生细菌是指能在健康植物组织内栖居且对植物不造成危害并建立和谐联合关系的细菌[1]。研究表明，内生细菌为植物微生态系统天然组成部分，其存在可提高植物对恶劣环境的适应性及促进寄主植物生长，还可作为潜在的内生拮抗细菌加以利用，减少化学农药造成的环境污染，提高农田生态系统的多样性，保持生态平衡[2]。植物内生细菌多样性和群落结构不仅因作物种类不同而存在差异[3]，还随着植物生长期、组织器官不同而有差别[4-5]。笔者以桂单0810、迪卡008、正大619这3个玉米品种苗期和穗期的不同组织为研究对象，采用组织研磨匀浆方法分离培养内生细菌，结合形态生理特征和16S rDNA基因序列同源性比对分析对菌株进行了分类，并测定了所分离的菌株对4种玉米病原菌的拮抗作用，旨在为玉米病害的生物防治提供参考。
1材料与方法
1.1材料玉米品种为桂单0810、迪卡008和正大619。细菌基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司产品；Taq PCR Mix为北京全式金生物技术有限公司产品；Gene JET为Thermo Scientific 公司产品。
1.2方法
1.2.1玉米种植与样本采集。将玉米品种桂单0810、迪卡008和正大619植于广西农业科学院明阳实验基地，随机区组排列，每个品种种植3个小区，每个小区5行，行长4.00 m，行距0.65 m，每行17株。于苗期和抽穗期进行样本采集，采用5点取样法，每点采4株。
1.2.2内生细菌的分离与纯化。
将样本用自来水冲洗干净，称取根、茎、叶各1.0 g，75%乙醇表面消毒1 min，0.1%氯化汞消毒根3 min、茎2 min、叶片1 min，无菌水冲洗3次后，加10 mL无菌水研磨至匀浆，吸取最后一次冲洗液（作为对照）和匀浆各1 mL稀释1 000倍，分别取1 mL稀释液置于培养皿，倒入营养琼脂（NA）固体培养基25 mL并混匀，28 ℃培养24～72 h。根据菌落的颜色和形态分类，计数，挑取菌落形态、色泽及培养基颜色等不同的菌株按常规方法纯化，纯化菌株转接入含有80%甘油的离心管中，4 ℃保存备用。
1.2.3细菌形态学鉴定。形态学鉴定包括菌落外形观察、革兰氏染色和显微镜观察[6]。
1.2.4细菌基因组DNA提取。
使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，操作按说明书进行，使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及其完整性，-40 ℃保存备用。
1.2.5细菌16S rDNA的PCR扩增与测序。采用通用引物对细菌16S rDNA片段进行PCR扩增，上游引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增体系为20 μL，其中含10 μL 2× Taq PCR Mix，2 μL DNA，4 μmol/L上、下游引物各1 μL，6 μL双蒸水。扩增程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36个循环；72 ℃延伸10 min。使用Gene JET胶回收试剂盒回收PCR，委托上海生工生物工程有限公司测序。
1.2.6序列生物信息分析。
将获得的16S rDNA序列与NCBI数据库中已知序列进行同源性比对，采用基因序列分析软件DNAMAN和系统发育树构建软件MEGA 7.0，与基因GenBank 数据库中相关属种基因序列进行系统发育树分析[7]。
1.2.7拮抗作用鉴定。
以玉米纹枯病、玉米大斑病、玉米小斑病和玉米茎腐病4种病原菌为供试病原菌，对分离到的内生细菌进行拮抗作用测试。采用平板对峙法，将已活化的直径5 mm的病原菌块接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板培养基中央，病原菌块四周等距离接入分离到的菌株，28 ℃培养7 d后测量病原菌向拮抗菌方向的生长距离，以仅接种病原菌块的平板为对照，计算抑菌率。
抑菌率=（对照病原菌菌落半径-病原菌向拮抗菌方向生长距离）/对照病原菌菌落半径×100%
2结果与分析
2.1内生细菌的分离数量及鉴定
从苗期各组织样本中分离获得内生细菌36株，从穗期样本中分离得到46株；从根中分离得到的菌株数量最多，为44株，茎中数量次之，为21株，叶中数量最少，为17株；从桂单0810获得的菌株数量最多，为36株，迪卡008次之，为28株（表1）。对获得的内生细菌进行形态学观察、生理生化反应和16S rDNA序列比对分析发现，82株内生细菌分属于芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）4个属（图1），其中芽孢杆菌属为优势类群，菌株数量为52株，占总数的63.4%（表1）。 2.2内生细菌类群的变化
随着生育期变化，植株内生细菌种类也有所变化。其中，桂单0810、迪卡008从苗期到穗期的内生细菌种类有所增加，桂单0810苗期未分离到假单胞菌属，但穗期阶段获得了假单胞菌属；迪卡008苗期只含有芽孢杆菌属
和肠杆菌属，穗期多分离到黄单胞菌属和假单胞菌属，正大619的内生细菌种类在不同生育期无变化（表2）。可见，不同品种的内生细菌种类变化情况存在差异。
2.3内生细菌数量的变化
分离计数发现，玉米植株内生细菌数量随着生育期发展呈上升趋势，其中桂单0810增幅最大，由苗期的1.983×104 cfu/g增长至穗期的12.307×104 cfu/g，增加了6.2倍。穗期各品种间的内生细菌总量差异达到显著水平，表明不同品种间内生细菌的富集能力存在差异，桂单0810较其他2个品种更易诱捕到内生细菌定殖繁
殖（表3）。
2.4拮抗作用鉴定
结果表明，82株内生细菌中，有8株对
4种病原菌表现出不同程度的拮抗作用，其中菌株GD16对4种病原菌均表现出不同程度的拮抗作用（表4）。
3结论与讨论
该研究结合形态学特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列比对分析法对分离到的82株细菌进行鉴定。结果表明，玉米内生细菌的多样性较丰富，共鉴定出芽孢杆菌属、肠杆菌属、黄单胞菌属、假单胞菌属4个属，以芽孢杆菌属为主，这与前人的分离结果一致[8]。
玉米内生细菌的种类、数量与品种的遗传背景及植株组织部位相关[5]。该研究表明，桂单0810和迪卡008均分离到4个属的内生细菌，而正大619只分离到3个属，其中桂单0810分离到的菌株数量最多，可能是该品种为当地选育品种，比较适应当地的生态环境和菌株的入侵。3个品种均表现为根组织中内生细菌的数量最大，茎和叶中数量次之，原因可能是由于根系统是内生细菌进入植物的入口，所以根聚集内生细菌比其他器官多[9]。在分离到的82株内生细菌中，有8株对玉米纹枯病菌等4种病原菌有拮抗作用，其中4株（GD08、GD16、ZD13、DK17）为芽孢杆菌属，1株（DK27）为假单胞菌属。芽孢杆菌在玉米中分布广、菌量大，在玉米植株过程中具有稳定的内生特性，并能够形成芽孢，抵抗外界不良环境，有些菌株对植物病害有较好的防治作用[10]。假单胞菌属是作物中具有稳定溶磷效应的优势菌种，分离自玉米的溶磷内生细菌，具有ACC脱氨酶活性，可以促进植株生长和防治植物病害[11]。并且假单胞菌能产生多种抗生素，改善植物营养，促进植物生长，并降解土壤中有毒物质，对植株促生及防病作用明显[12]。因此，该研究对3个玉米品种内生细菌的分离鉴定可为进一步研究细菌种属多样性与玉米品种特性的关系，并获得有益微生物资源奠定基础。
参考文献
[1]
HALLMANN J，QUDATHALLMANN A，MAHAFFEE W F，et al.Bacterial endophytes in agricultural crops[J].Can J Microbiol，1997，43（1）：895-914.
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[4] 刘洋，左山，鄒媛媛，等.杂交玉米农大108及其亲本种子内生细菌群落的多样性[J].中国农业科学，2011（23）：4763-4771.
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[6] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：365-375.
[7] KUMAR S，STECHER G，TAMURA K.MEGA7：Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J].Mol Biol Evol，2016，33（7）：1870-1874.
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[9] 刘云霞，张青文，周明详.水稻体内细菌的动态研究[J].应用生态学报，1999（10）：735-738.
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[11] 沈萍，闫淑珍，陈双林，等.具ACC脱氨酶活性的植物内生细菌对辣椒的促生作用和对疫霉病的防治作用[J].植物保护学报，2008，35（1）：28-32.
[12] 滕松山，刘艳萍，赵蕾.具ACC脱氨酶活性的碱蓬内生细菌的分离、鉴定及其生物学特性[J].微生物学报，2010，50（11）：1503-1509.