【摘 要】
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为建立检测草鱼白介素10(CiIL-10)的双抗体夹心 ELISA方法,首先克隆CiIL-10基因、构建与表达原核表达重组质粒pET-32a-CiIL-10,并对表达产物进行纯化,以获得重组CiIL-10(rCiI
【机 构】
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安徽农业大学动物科技学院,合肥230036
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为建立检测草鱼白介素10(CiIL-10)的双抗体夹心 ELISA方法,首先克隆CiIL-10基因、构建与表达原核表达重组质粒pET-32a-CiIL-10,并对表达产物进行纯化,以获得重组CiIL-10(rCiIL-10)纯化蛋白.然后,以纯化的rCiIL-10蛋白为免疫原制备兔源及鼠源抗rCiIL-10的多克隆抗体,并对其进行纯化与酶标记.最后,以纯化的鼠抗rCiIL-10抗体为捕获抗体,rCiIL-10纯化蛋白为夹心抗原,HRP标记的兔抗CiIL-10纯化抗体为检测抗体,通过优化反应条件,建立双抗体夹心 ELISA检测方法.结果显示,该方法的优化反应条件包括,捕获抗体的最佳包被浓度为20μg·mL-1,检测抗体的最佳稀释度为1 ∶ 3 200,最佳封闭条件是使用5％脱脂奶粉,37℃封闭1.5 h,样品反应时间为2 h,以OD450值≥0.174作为阳性判定标准.该方法的板内及板间重复性变异系数小于10％,最低检测限量为24.29 ng·mL-1,与草鱼白介素6、草鱼肿瘤坏死因子、小鼠白介素10、小鼠干扰素和小鼠单核细胞趋化蛋白均无交叉反应.结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有较好的特异性、重复性和灵敏度,可用于草鱼白介素10的快速检测.
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