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摘要：为检测地塞米松对猪感染PRRSV后免疫力及致病性的影响，将6头健康猪平分为2组，分别注射地塞米松和生理盐水，连续注射3 d。检测注射前、注射后1周的PRRSV抗体阳性率及病毒量，观察并记录体温、呼吸、饮食、眼结膜、粪便等临床情况。结果显示，猪的PRRSV抗体阳性率为100%，但注射后的抗体值高于注射前；病毒蛋白半定量结果显示病毒感染量显著增加；注射地塞米松组的猪表现出一定临床症状，而对照组未发生变化。结果表明，地塞米松会增加PRRSV的发病风险，为建立防治PRRSV感染的动物模型奠定了基础，为兽医临床中合理使用糖皮质激素类药物提出新的要求。
关键词：糖皮质类激素；地塞米松；猪繁殖与呼吸综合征病毒；致病性
中图分类号： S858.28 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0293-02
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）广泛存在于各养殖场，可引发免疫逃避，呈带毒但不发病、条件性致病状态[1]。发病时表现为PRRSV与其他病原同时存在，呈继发或并发感染[2]。病猪的临床症状变化较大，通常出现体温升高、食欲下降、气喘咳嗽、肢体末端瘀血、共济失调、运动减少、精神状态不佳等症状，死亡率达50%以上，母猪流产率达30%以上，给养猪业造成了巨大损失[3-4]。PRRSV抗体产生较早，但初始1周内产生的抗体不具有中和作用，仅能作为一种指示性抗体用于病毒感染的早期检测；中和抗体产生比较缓慢，一般于病毒感染后1～2个月出现[5]。
地塞米松为代表性糖皮质激素类药物，对抗炎、免疫抑制、抗内毒素、抗休克、影响代谢具有显著作用[6-10]，在兽医临床中被广泛应用于治疗母畜代谢病，或与抗生素联合用于治疗感染性疾病。有报道表明，地塞米松等糖皮质激素可上调PRRSV受体的表达[11]，促进PRRSV感染或致病。拟将地塞米松注射于健康猪，通过临床症状、标志性抗体、病毒量等方面摸索开展PRRSV试验感染的条件，为建立防治PRRSV感染的动物模型奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料
猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所。地塞米松（国药准字H41020036）由江苏农牧科技职业学院动物实习医院提供。RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、Taq DNA聚合酶、1 kb DNA Ladder、琼脂糖、病毒RNA提取试剂盒均购自美国Promega公司。
1.2 试验动物
30日龄健康仔猪购自江苏省如皋市某规模化养殖猪场。
1.3 猪群PRRSV抗体检测
在如皋市某猪场选取10头未发病的30日龄仔猪，无菌采血并分离血清，按照猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒使用说明书检测抗体水平，分别读取D450 nm，每个血清样品做2个重复。按照该试剂盒的判断标准，被检血清平均吸光值（S）/标准阴性血清平均吸光值（N）值≥2.40判为阳性，<2.40判为阴性。
1.4 适应性饲养与药物注射
根据S/N值判断仔猪的PRRSV抗体阳性率，选择其中读值较低的6头猪，分别称其质量，用耳号钳标记，适应性饲养于经氯仿消毒的畜舍。3 d后，将1～3号猪作为地塞米松注射组，按0.067 mg/kg的剂量进行肌肉注射，每天09：00、15：00各1次，连续注射3 d；将4～6号猪作为生理盐水注射组（阴性对照）。
1.5 临床症状观察
自注射地塞米松1 d起每天观察并记录食欲、精神状态、皮肤、呼吸、眼结膜、体温、粪便等临床癥状，连续观察7 d。
1.6 试验猪PRRSV抗体检测
于停止注射1周后无菌采集猪血并分离血清，按照“1.3”节的抗体检测方法分别测定6头猪的D450 nm。
1.7 病毒半定量测定
根据GenBank已公布的高致病性PRRSV（HP-PRRSV）、低致病性PRRSV（LP-PRRSV）的Nsp2基因序列，分别设计能扩增出400 bp或（和）264 bp的特异性上、下游引物，同时设计能扩增出600 bp β-actin的上、下游引物[12]。于注射1周后采集6头猪的唾液，按照病毒RNA提取试剂盒说明书提取其总RNA，进行Nsp2基因的半定量RT-PCR检测，电泳后采用ND-1000型分光光度计进行灰度扫描，根据各组Nsp2基因变化判断病毒量。
2 结果与分析
2.1 猪群PRRSV抗体
按照PRRSV抗体检测试剂盒说明书，测得10头未发病30日龄仔猪的PRRSV抗体D450 nm值（表1），根据该试剂盒的判断标准，判断10头被检猪的阳性率为100%，但是均未发病。
2.2 临床发病记录
按照D450 nm值由低到高的顺序选择6头被检猪进行分组试验，自注射地塞米松1 d起观察每头猪的临床症状。结果显示，生理盐水注射组（对照组）未出现明显临床症状，地塞米松注射组（试验组）的猪出现食欲下降、精神萎靡、皮肤瘀血、眼结膜潮红、腹泻症状。体温记录见图1，呼吸数记录（n=3）见图2，试验组的体温与呼吸数于注射地塞米松3 d起开始升高。
2.3 试验猪PRRSV抗体
于停止注射1周后测定猪的PRRSV抗体水平，D450 nm吸光值见表2。根据该试剂盒的判断标准，判断试验猪的阳性率与注射前一致，均为100%，但注射组血清的吸光值明显高于对照组血清。
2.4 病毒基因半定量测定
唾液样品中病毒基因Nsp2的RT-PCR半定量检测结果见图3。6头猪均为LP-PRRSV病毒感染，而无HP-PRRSV病毒感染，试验组猪的病毒基因表达量比对照组提高3倍左右。 3 结论与讨论
PRRSV病毒嗜好在肺泡巨噬细胞（PAM）、肺血管内巨噬细胞（PM）内复制[13]，可在数小时至数天内破坏大量巨噬细胞，造成肺、淋巴结的损伤，使其对异物的非特异性吞噬清除功能大幅降低，易继发其他细菌或病毒感染[2]。已有研究表明，其他病原的协同感染往往可刺激PRRSV受体表达，从而使猪更易感染，这是PRRSV常与其他疾病同时存在的根本原因。自然状态下的PRRSV复制不易成功，为在实验室开展PRRS的攻毒保护试验，有必要摸索PRRSV的感染条件。地塞米松等糖皮质激素可上调PRRSV受体的表达[11]，理论上可模拟其他病原促进PRRSV感染或致病。本研究选取感染PRRSV但未发病的猪为试验动物，人为注射地塞米松，结果显示地塞米松注射组的猪可在短时间内出现典型的PRRS症状，且抗体水平及病毒量均明显上升，而对照组未出现异常症状。结果表明，地塞米松可作为诱导剂增加猪感染PRRSV的风险并引起发病，可为今后建立PRRSV相关研究的试验动物模型奠定基础。
动物模型的建立一般应选择SPF动物，在隔离条件下进行试验。鉴于PRRSV带毒猪多、PRRSV抗体阴性猪场较少、SPF猪价格昂贵且运输不便等试验条件的限制，本试验选取带毒未发病仔猪，确保其他条件完全一致的情况下设立试验组与对照组，从临床症状、标志性抗体、病毒量方面判断地塞米松对PRRSV感染的影响，结果与预期一致，表明此方案具有可行性。
参考文献：
[1]Kimman T G，Cornelissen L A，Moormann R J，et al. Challenges for porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV） vaccinology[J]. Vaccine，2009，27（28）：3704-3718.
[2]Rovira A，Balasch M，Segalés J，et al. Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2[J]. Journal of Virology，2002，76（7）：3232-3239.
[3]童光志，周艳君，郝晓芳，等. 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[J]. 中国预防兽医学报，2007，29（5）：323-327.
[4]田克恭. 高致病性猪蓝耳病流行现状与免疫防控进展[J]. 中国猪业，2010（6）：9-11.
[5]李伟娟. 猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析及感染后抗体消长规律的研究[D]. 郑州：河南农业大学，2009.
[6]史家欣，李家树. 糖皮质激素抗炎作用机制的研究进展[J]. 实用医学杂志，2014，30（6）：983-984.
[7]王金泉，刘志红. 糖皮质激素免疫抑制作用机理的新认识[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6（2）：57-59.
[8]张丽丽，赵欣欣，杨 琦，等. 糖皮质激素对内毒素耐受的影响[J]. 实用药物与临床，2014，17（6）：724-727.
[9]季宪飞，李春盛. 糖皮质激素在感染性休克治疗中的作用及评价[J]. 中国实用外科杂志，2009，29（12）：989-992.
[10]高 静.糖皮质激素对肉仔鸡骨骼肌蛋白代谢影响的研究[D]. 泰安：山东农业大学，2011.
[11]Chen Y，Guo R，He S，et al. Additive inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection with the soluble sialoadhesin and CD163 receptors[J]. Virus Research，2014，179（1）：85-92.
[12]安春霞，闫若潜，吴志明，等. 高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 中國畜牧兽医，2013，40（5）：66-70.
[13]Thanawongnuwech R，Thacker E L，Halbur P G. Effect of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）（isolate ATCC VR-2385） infection on bactericidal activity of porcine pulmonary intravascular macrophages（PIMs）：in vitro comparisons with pulmonary alveolar macrophages（PAMs）[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology，1997，59（3/4）：323-335.
关键词：糖皮质类激素；地塞米松；猪繁殖与呼吸综合征病毒；致病性
中图分类号： S858.28 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0293-02
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）广泛存在于各养殖场，可引发免疫逃避，呈带毒但不发病、条件性致病状态[1]。发病时表现为PRRSV与其他病原同时存在，呈继发或并发感染[2]。病猪的临床症状变化较大，通常出现体温升高、食欲下降、气喘咳嗽、肢体末端瘀血、共济失调、运动减少、精神状态不佳等症状，死亡率达50%以上，母猪流产率达30%以上，给养猪业造成了巨大损失[3-4]。PRRSV抗体产生较早，但初始1周内产生的抗体不具有中和作用，仅能作为一种指示性抗体用于病毒感染的早期检测；中和抗体产生比较缓慢，一般于病毒感染后1～2个月出现[5]。
地塞米松为代表性糖皮质激素类药物，对抗炎、免疫抑制、抗内毒素、抗休克、影响代谢具有显著作用[6-10]，在兽医临床中被广泛应用于治疗母畜代谢病，或与抗生素联合用于治疗感染性疾病。有报道表明，地塞米松等糖皮质激素可上调PRRSV受体的表达[11]，促进PRRSV感染或致病。拟将地塞米松注射于健康猪，通过临床症状、标志性抗体、病毒量等方面摸索开展PRRSV试验感染的条件，为建立防治PRRSV感染的动物模型奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料
猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所。地塞米松（国药准字H41020036）由江苏农牧科技职业学院动物实习医院提供。RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、Taq DNA聚合酶、1 kb DNA Ladder、琼脂糖、病毒RNA提取试剂盒均购自美国Promega公司。
1.2 试验动物
30日龄健康仔猪购自江苏省如皋市某规模化养殖猪场。
1.3 猪群PRRSV抗体检测
在如皋市某猪场选取10头未发病的30日龄仔猪，无菌采血并分离血清，按照猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒使用说明书检测抗体水平，分别读取D450 nm，每个血清样品做2个重复。按照该试剂盒的判断标准，被检血清平均吸光值（S）/标准阴性血清平均吸光值（N）值≥2.40判为阳性，<2.40判为阴性。
1.4 适应性饲养与药物注射
根据S/N值判断仔猪的PRRSV抗体阳性率，选择其中读值较低的6头猪，分别称其质量，用耳号钳标记，适应性饲养于经氯仿消毒的畜舍。3 d后，将1～3号猪作为地塞米松注射组，按0.067 mg/kg的剂量进行肌肉注射，每天09：00、15：00各1次，连续注射3 d；将4～6号猪作为生理盐水注射组（阴性对照）。
1.5 临床症状观察
自注射地塞米松1 d起每天观察并记录食欲、精神状态、皮肤、呼吸、眼结膜、体温、粪便等临床癥状，连续观察7 d。
1.6 试验猪PRRSV抗体检测
于停止注射1周后无菌采集猪血并分离血清，按照“1.3”节的抗体检测方法分别测定6头猪的D450 nm。
1.7 病毒半定量测定
根据GenBank已公布的高致病性PRRSV（HP-PRRSV）、低致病性PRRSV（LP-PRRSV）的Nsp2基因序列，分别设计能扩增出400 bp或（和）264 bp的特异性上、下游引物，同时设计能扩增出600 bp β-actin的上、下游引物[12]。于注射1周后采集6头猪的唾液，按照病毒RNA提取试剂盒说明书提取其总RNA，进行Nsp2基因的半定量RT-PCR检测，电泳后采用ND-1000型分光光度计进行灰度扫描，根据各组Nsp2基因变化判断病毒量。
2 结果与分析
2.1 猪群PRRSV抗体
按照PRRSV抗体检测试剂盒说明书，测得10头未发病30日龄仔猪的PRRSV抗体D450 nm值（表1），根据该试剂盒的判断标准，判断10头被检猪的阳性率为100%，但是均未发病。
2.2 临床发病记录
按照D450 nm值由低到高的顺序选择6头被检猪进行分组试验，自注射地塞米松1 d起观察每头猪的临床症状。结果显示，生理盐水注射组（对照组）未出现明显临床症状，地塞米松注射组（试验组）的猪出现食欲下降、精神萎靡、皮肤瘀血、眼结膜潮红、腹泻症状。体温记录见图1，呼吸数记录（n=3）见图2，试验组的体温与呼吸数于注射地塞米松3 d起开始升高。
2.3 试验猪PRRSV抗体
于停止注射1周后测定猪的PRRSV抗体水平，D450 nm吸光值见表2。根据该试剂盒的判断标准，判断试验猪的阳性率与注射前一致，均为100%，但注射组血清的吸光值明显高于对照组血清。
2.4 病毒基因半定量测定
唾液样品中病毒基因Nsp2的RT-PCR半定量检测结果见图3。6头猪均为LP-PRRSV病毒感染，而无HP-PRRSV病毒感染，试验组猪的病毒基因表达量比对照组提高3倍左右。 3 结论与讨论
PRRSV病毒嗜好在肺泡巨噬细胞（PAM）、肺血管内巨噬细胞（PM）内复制[13]，可在数小时至数天内破坏大量巨噬细胞，造成肺、淋巴结的损伤，使其对异物的非特异性吞噬清除功能大幅降低，易继发其他细菌或病毒感染[2]。已有研究表明，其他病原的协同感染往往可刺激PRRSV受体表达，从而使猪更易感染，这是PRRSV常与其他疾病同时存在的根本原因。自然状态下的PRRSV复制不易成功，为在实验室开展PRRS的攻毒保护试验，有必要摸索PRRSV的感染条件。地塞米松等糖皮质激素可上调PRRSV受体的表达[11]，理论上可模拟其他病原促进PRRSV感染或致病。本研究选取感染PRRSV但未发病的猪为试验动物，人为注射地塞米松，结果显示地塞米松注射组的猪可在短时间内出现典型的PRRS症状，且抗体水平及病毒量均明显上升，而对照组未出现异常症状。结果表明，地塞米松可作为诱导剂增加猪感染PRRSV的风险并引起发病，可为今后建立PRRSV相关研究的试验动物模型奠定基础。
动物模型的建立一般应选择SPF动物，在隔离条件下进行试验。鉴于PRRSV带毒猪多、PRRSV抗体阴性猪场较少、SPF猪价格昂贵且运输不便等试验条件的限制，本试验选取带毒未发病仔猪，确保其他条件完全一致的情况下设立试验组与对照组，从临床症状、标志性抗体、病毒量方面判断地塞米松对PRRSV感染的影响，结果与预期一致，表明此方案具有可行性。
参考文献：
[1]Kimman T G，Cornelissen L A，Moormann R J，et al. Challenges for porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV） vaccinology[J]. Vaccine，2009，27（28）：3704-3718.
[2]Rovira A，Balasch M，Segalés J，et al. Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2[J]. Journal of Virology，2002，76（7）：3232-3239.
[3]童光志，周艳君，郝晓芳，等. 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[J]. 中国预防兽医学报，2007，29（5）：323-327.
[4]田克恭. 高致病性猪蓝耳病流行现状与免疫防控进展[J]. 中国猪业，2010（6）：9-11.
[5]李伟娟. 猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析及感染后抗体消长规律的研究[D]. 郑州：河南农业大学，2009.
[6]史家欣，李家树. 糖皮质激素抗炎作用机制的研究进展[J]. 实用医学杂志，2014，30（6）：983-984.
[7]王金泉，刘志红. 糖皮质激素免疫抑制作用机理的新认识[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6（2）：57-59.
[8]张丽丽，赵欣欣，杨 琦，等. 糖皮质激素对内毒素耐受的影响[J]. 实用药物与临床，2014，17（6）：724-727.
[9]季宪飞，李春盛. 糖皮质激素在感染性休克治疗中的作用及评价[J]. 中国实用外科杂志，2009，29（12）：989-992.
[10]高 静.糖皮质激素对肉仔鸡骨骼肌蛋白代谢影响的研究[D]. 泰安：山东农业大学，2011.
[11]Chen Y，Guo R，He S，et al. Additive inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection with the soluble sialoadhesin and CD163 receptors[J]. Virus Research，2014，179（1）：85-92.
[12]安春霞，闫若潜，吴志明，等. 高致病性与低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 中國畜牧兽医，2013，40（5）：66-70.
[13]Thanawongnuwech R，Thacker E L，Halbur P G. Effect of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）（isolate ATCC VR-2385） infection on bactericidal activity of porcine pulmonary intravascular macrophages（PIMs）：in vitro comparisons with pulmonary alveolar macrophages（PAMs）[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology，1997，59（3/4）：323-335.