构建人PKCI-1 /HINT1基因的真核表达质粒，研究其在人黑素瘤A375细胞株中的表达并检测其对A375细胞凋亡及自噬的影响。
方法以人黑素瘤细胞A375的总RNA为模板，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增PKCI-1/HINT1基因序列，将PKCI-1/HINT1基因克隆到真核表达载体PCDNA3.1 (+)中，构建PCDNA3.1(+)-PKCI-1/HINT1重组体。将PCDNA3.1(+)-PKCI-1/HINT1表达载体瞬时转染黑素瘤A375细胞， RT-PCR及Western印迹检测PKCI-1/HINT1在细胞内的表达，并以PCDNA3.1(+)空载体转染细胞作为相应对照组。噻唑蓝(MTT)检测PKCI-1/HINT1转染后细胞的增殖变化，Hoechest 33258染色检测细胞凋亡，采用绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(GFP-LC3)标记结合激光共聚焦显微镜法检测PKCI-1/HINT1对细胞自噬的的影响，并通过Western印迹检测PKCI-1/HINT1对细胞内caspase 3及自噬相关蛋白beclin1蛋白表达的影响。
结果PCDNA3.1(+)-PKCI-1 /HINT1真核表达载体经酶切及测序鉴定构建成功，并能够在细胞内有效表达。MTT检测发现PKCI-1 /HINT1能够明显抑制A375细胞的增殖，与PCDNA3.1(+)对照组相比，在48 h, 72 h及96 h PCDNA3.1 (+)-PKCI-1 /HINT1组活细胞数分别减少17.0% ，25.6%、29.4%，差异有统计学意义(均P < 0.05)。Hoechest 33258染色显示PKCI-1/HINT1可促进A375细胞内凋亡小体形成。激光共聚焦显微镜发现PKCI-1/HINT1的过表达可使A375细胞内GFP-LC3B的点状聚集增加。Western印迹发现，PKCI-1/HINT1可促进细胞内caspase 3及beclin1蛋白表达。
结论成功构建真核表达载体PCDNA3.1(+)-PKCI-1/HINT1并在细胞内有效表达PKCI-1/HINT1。PKCI-1 /HINT1的高表达可以抑制A375细胞增殖，促进其凋亡，同时可引发A375细胞的自噬过程。