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摘要：目的 采用高效液相色谱法（HPLC）测定天麻成分对甲氧基苄醇在大鼠血液中的药代动力学参数。方法 采用灌胃和静脉注射2种方式给药，HPLC测定不同时间大鼠血液中天麻成分对甲氧基苄醇的浓度，DAS3.0软件计算药代动力学参数。结果 大鼠血液中对甲氧基苄醇在0.63～321.17 μg/mL浓度范围内线性关系良好，r2=0.994 5；日内、日间精密度、绝对回收率和稳定性均在规定范围内。结论 本方法操作简便，能较准确地测出天麻成分对甲氧基苄醇在大鼠血液中的药代动力学参数。
关键词：高效液相色谱法；对甲氧基苄醇；药代动力学；大鼠
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0099-04
目前对于天麻的药代动力学研究大多以天麻素为主[1-2]。药代动力学对于指导临床安全合理用药及新药研发都具有重要意义[3]。本课题组前期研究发现天麻成分对甲氧基苄醇具有较好的脑保护作用，因此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定其在大鼠血液中的药代动力学参数，为后续研究提供依据。
1 动物、仪器与试药
SD大鼠，清洁级，雄性，10周龄，体质量220～250 g，四川省医学科学研究院动物研究所提供，动物合格证号SCXK（川）2008-24。
反相高效液相色谱仪，UltiMate3000；TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国Agilent；离心机， HITACHI；旋涡混合器XW-80A，上海精科实业有限公司。
对甲氧基苄醇，25 g，北京百灵威科技有限公司，批号134868。HPLC级甲醇，美国Spectrum；HPLC级乙腈，美国Spectrum；娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2.1 不同给药方式的样品处理
2.1.1 静脉注射 精密称取0.125 0 g对甲氧基苄醇于25 mL容量瓶中，用10%乙醇定容，0.45 μm孔径膜过滤备用。将大鼠用10%水合氯醛麻醉（0.3 mL/100 g），固定于鼠板，剪开颈部皮肤，钝性分离找到颈动脉，小心剥离迷走神经，远心端手术线结扎颈动脉，近心端用止血夹夹住，在手术线和止血夹之间的颈动脉血管上剪出小口，插入塑料细管，手术线结扎细管与血管贴壁处。在不同时间点松开止血夹即可取血。尾静脉注射给药量为50 mg/kg。分别于给药后2、4、6、8、10、12、20、30、45 min取血0.3 mL，6000 r/min离心10 min，取血浆0.1 mL，加入0.5 mL乙腈沉淀蛋白，涡旋3 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液氮气吹干，加入流动相0.4 mL，涡旋3 min，10 000 r/min离心10 min，装入含内存管进样品，HPLC进样自动检测。
2.1.2 灌胃 精密称取1.600 1 g对甲氧基苄醇于25 mL烧杯中，加入20 mL水，加入0.100 2 g羧甲基纤维素钠（即0.5%浓度），充分搅拌混匀备用。口服给药量为800 mg/kg。大鼠灌胃相应药物后用10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，固定于鼠板，剪开颈部皮肤，钝性分离找到颈动脉，小心剥离迷走神经，远心端手术线结扎颈动脉，近心端用止血夹夹住，在手术线和止血夹之间的颈动脉血管上剪出小口，插入塑料细管，手术线结扎细管与血管贴壁处。在不同时间点松开止血夹即可取血。分别于给药后10、13、16、19、22、25、30、45、60 min取血0.3 mL，6000 r/min离心10 min，取血浆0.1 mL，加入0.5 mL乙腈沉淀蛋白，涡旋3 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液氮气吹干，加入流动相0.4 mL，涡旋3 min，10 000 r/min离心10 min，装入含内存管进样品，HPLC进样自动检测。
2.2 测定方法的建立
2.2.1 色谱条件 TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流动相为甲醇-水（35∶65），流速0.3 mL/min，柱温25 ℃，进样量20 μL，检测波长278 nm，目标峰与杂质峰能有效分离，两者分离度>1.5，符合要求。对甲氧基苄醇的保留时间在9.7 min左右。色谱图见图1。
2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取192.70 mg对甲氧基苄醇于250 mL容量瓶中，乙腈定容，作为母液。制备浓度为321.17、160.59、80.29、40.15、20.07、10.04、5.02、2.51、1.25、0.63 μg/mL的含药血样，制作标准曲线，计算得回归方程Y=0.0663X-0.2181（r2=0.9945）。
2.2.3 最低检测限和最低定量限 在制作标准曲线时，含药血清相应峰高与噪音峰高比值即信噪比（S/N）为3∶1时的浓度即为最低检测限（LOD），S/N为10∶1时的浓度为最低定量限（LOQ）。结果测得对甲氧基苄醇的最低检测限为0.19 μg/mL，最低定量限为0.63 μg/mL。
2.2.4 精密度和绝对回收率 将高（360 μg/mL）、中（100 μg/mL）、低（30 μg/mL）3种浓度的含药血样及同浓度标准含药溶液，连续测定5次，得到对照品峰面积，代入标准曲线计算得到对照品浓度，计算RSD，考察方法的日内精密度，分别3 d重复操作考察方法的日间精密度。要求低浓度的精密度RSD在±20%之间，中、高浓度的精密度RSD在15%范围内。结果其精密度均符合要求，见表1。
将高、中、低3种浓度的含药血样及同浓度标准含药溶液进行HPLC测定，二者峰面积的比值即为该浓度药物在血中的绝对回收率，结果见表2。
2.2.5 冻融试验 将低、中、高3种浓度的含药血样置于-20 ℃冰箱24、48 h和反复冻融3次后测定其含药量的变化，计算RSD值。要求低浓度的精密度RSD在±20%之间，中、高浓度的精密度RSD在15%范围内。结果见表3。可以看出，冻融变化不在要求范围内，故本试验均应取血后立即处理并于当日检测，尽量避免长时间反复冻融。 2.2.6 稳定性考察 制备高、中、低3个浓度的含药血样3份，分别在室温下放置10、24 h，然后进样测定，将测得的结果与0时测得的结果进行比较考察药物的稳定性。结果含对甲氧基苄醇的血液分别在室温下放置10、24 h和按“2.1”样品处理方法得到的样品室温下放置24 h后的数据与0时测得的结果进行比较，样品在上述条件下是稳定的，见表4。
2.3 天麻成分对甲氧基苄醇在大鼠血液中的药代动力学参数
采用DAS3.0软件进行数据处理，绘制药物浓度-时间曲线，见图2。对甲氧基苄醇的药代动力学参数以非房室模型统计矩计算，见表5。天麻成分对甲氧基苄醇的绝对生物利用度为35.5%。
3 讨论
随着分析技术的发展，色谱技术在进样方式、分离模式、检测技术及适用对象等方面也得到迅速发展，是药代动力学研究中不可缺少的一项技术[3]。HPLC是研究生物样品及其代谢产物非常重要的方法，不受样品挥发性的约束，适用范围非常广，分离效率高而且组分容易回收，稳定性好，灵敏度高，是目前药代动力学研究中常用的分析方法。建立稳定、精确的对甲氧基苄醇专属HPLC测定方法是对甲氧基苄醇在血液中药代动力学参数检测的前提条件，也是检测过程的方法学保障。
静脉注射给药时，药物直接迅速进入血液而不受吸收的影响[4]。因此，可以单纯研究对甲氧基苄醇在血液中的变化情况，不受其他影响因素的干扰。由于其他给药方式指标成分需经过许多复杂的过程才会进入血液，如果仅有微量药物进入血液，再经过多个步骤的样品处理，可能会导致在血液中检测不到目标成分[5]。静脉注射给药对于首次研究对甲氧基苄醇在血液中的变化情况有积极的意义，对甲氧基苄醇直接静脉给药可以明确得知血液中肯定含有该成分，在确定样品处理方法的时候操作难度就会减小，可以得到更为优化、精确的实验体系和方法[6-7]。
口服给药是常用的给要途径，其吸收部位是胃肠道，影响因素有很多，如药物本身的理化性质和胃肠功能等。天麻的使用方法主要为口服给药，研究灌胃给药后大鼠血液中对甲氧基苄醇的药代动力学参数可以为天麻成分对甲氧基苄醇的临床应用提供可靠的依据，包括对甲氧基苄醇给药时间间隔、药物在血液中的变化过程等。
参考文献：
[1] 杨园，杜鹏，陈勇，等.不同剂量天麻提取物中天麻素在大鼠体内的药动学研究[J].中医药学报，2010，38（5）：94-97.
[2] 罗军，吴中亮，王惠先.天麻素注射液人体药动学的研究[J].解放军药学学报，2006，22（5）：391-393.
[3] Lin HS， Zhang W， Go ML， et al. Determination of Z-3，5，4'- trimethoxystilbene in rat plasma by a simple HPLC method：application in a pre-clinical pharmacokinetic study[J]. J Pharm Biomed Anal，2010，53（3）：693-697.
[4] Haug KG， Weber B， Hochhaus G， et al. Nonlinear pharmacokinetics of visnagin in rats after intravenous bolus administration[J]. Eur J Pharm Sci，2012，45（1/2）：79-89.
[5] Xie Y， Zhong G， He H， et al. Pharmacokinetics， tissue distribution and excretion of porcine fibrinogen after intraperitoneal injection of a porcine-derived fibrin glue to rats[J]. J Pharm Biomed Anal，2011，54（1）：148-153.
[6] Kreil VE， Ambros L， Montoya L， et al. Pharmacokinetics of sodium and trihydrate amoxicillin after intravenous and intramuscular administration in llamas （Lama glama）[J]. Small Ruminant Research， 2012，102（2/3）：208-212.
[7] Chen J， Xiao HL， Hu RR， et al. Pharmacokinetics of brucine after intravenous and oral administration to rats[J]. Fitoterapia， 2011，82（8）：1302-1308.
（收稿日期：2014-11-25；编辑：陈静）
关键词：高效液相色谱法；对甲氧基苄醇；药代动力学；大鼠
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0099-04
目前对于天麻的药代动力学研究大多以天麻素为主[1-2]。药代动力学对于指导临床安全合理用药及新药研发都具有重要意义[3]。本课题组前期研究发现天麻成分对甲氧基苄醇具有较好的脑保护作用，因此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定其在大鼠血液中的药代动力学参数，为后续研究提供依据。
1 动物、仪器与试药
SD大鼠，清洁级，雄性，10周龄，体质量220～250 g，四川省医学科学研究院动物研究所提供，动物合格证号SCXK（川）2008-24。
反相高效液相色谱仪，UltiMate3000；TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国Agilent；离心机， HITACHI；旋涡混合器XW-80A，上海精科实业有限公司。
对甲氧基苄醇，25 g，北京百灵威科技有限公司，批号134868。HPLC级甲醇，美国Spectrum；HPLC级乙腈，美国Spectrum；娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2.1 不同给药方式的样品处理
2.1.1 静脉注射 精密称取0.125 0 g对甲氧基苄醇于25 mL容量瓶中，用10%乙醇定容，0.45 μm孔径膜过滤备用。将大鼠用10%水合氯醛麻醉（0.3 mL/100 g），固定于鼠板，剪开颈部皮肤，钝性分离找到颈动脉，小心剥离迷走神经，远心端手术线结扎颈动脉，近心端用止血夹夹住，在手术线和止血夹之间的颈动脉血管上剪出小口，插入塑料细管，手术线结扎细管与血管贴壁处。在不同时间点松开止血夹即可取血。尾静脉注射给药量为50 mg/kg。分别于给药后2、4、6、8、10、12、20、30、45 min取血0.3 mL，6000 r/min离心10 min，取血浆0.1 mL，加入0.5 mL乙腈沉淀蛋白，涡旋3 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液氮气吹干，加入流动相0.4 mL，涡旋3 min，10 000 r/min离心10 min，装入含内存管进样品，HPLC进样自动检测。
2.1.2 灌胃 精密称取1.600 1 g对甲氧基苄醇于25 mL烧杯中，加入20 mL水，加入0.100 2 g羧甲基纤维素钠（即0.5%浓度），充分搅拌混匀备用。口服给药量为800 mg/kg。大鼠灌胃相应药物后用10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，固定于鼠板，剪开颈部皮肤，钝性分离找到颈动脉，小心剥离迷走神经，远心端手术线结扎颈动脉，近心端用止血夹夹住，在手术线和止血夹之间的颈动脉血管上剪出小口，插入塑料细管，手术线结扎细管与血管贴壁处。在不同时间点松开止血夹即可取血。分别于给药后10、13、16、19、22、25、30、45、60 min取血0.3 mL，6000 r/min离心10 min，取血浆0.1 mL，加入0.5 mL乙腈沉淀蛋白，涡旋3 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液氮气吹干，加入流动相0.4 mL，涡旋3 min，10 000 r/min离心10 min，装入含内存管进样品，HPLC进样自动检测。
2.2 测定方法的建立
2.2.1 色谱条件 TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流动相为甲醇-水（35∶65），流速0.3 mL/min，柱温25 ℃，进样量20 μL，检测波长278 nm，目标峰与杂质峰能有效分离，两者分离度>1.5，符合要求。对甲氧基苄醇的保留时间在9.7 min左右。色谱图见图1。
2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取192.70 mg对甲氧基苄醇于250 mL容量瓶中，乙腈定容，作为母液。制备浓度为321.17、160.59、80.29、40.15、20.07、10.04、5.02、2.51、1.25、0.63 μg/mL的含药血样，制作标准曲线，计算得回归方程Y=0.0663X-0.2181（r2=0.9945）。
2.2.3 最低检测限和最低定量限 在制作标准曲线时，含药血清相应峰高与噪音峰高比值即信噪比（S/N）为3∶1时的浓度即为最低检测限（LOD），S/N为10∶1时的浓度为最低定量限（LOQ）。结果测得对甲氧基苄醇的最低检测限为0.19 μg/mL，最低定量限为0.63 μg/mL。
2.2.4 精密度和绝对回收率 将高（360 μg/mL）、中（100 μg/mL）、低（30 μg/mL）3种浓度的含药血样及同浓度标准含药溶液，连续测定5次，得到对照品峰面积，代入标准曲线计算得到对照品浓度，计算RSD，考察方法的日内精密度，分别3 d重复操作考察方法的日间精密度。要求低浓度的精密度RSD在±20%之间，中、高浓度的精密度RSD在15%范围内。结果其精密度均符合要求，见表1。
将高、中、低3种浓度的含药血样及同浓度标准含药溶液进行HPLC测定，二者峰面积的比值即为该浓度药物在血中的绝对回收率，结果见表2。
2.2.5 冻融试验 将低、中、高3种浓度的含药血样置于-20 ℃冰箱24、48 h和反复冻融3次后测定其含药量的变化，计算RSD值。要求低浓度的精密度RSD在±20%之间，中、高浓度的精密度RSD在15%范围内。结果见表3。可以看出，冻融变化不在要求范围内，故本试验均应取血后立即处理并于当日检测，尽量避免长时间反复冻融。 2.2.6 稳定性考察 制备高、中、低3个浓度的含药血样3份，分别在室温下放置10、24 h，然后进样测定，将测得的结果与0时测得的结果进行比较考察药物的稳定性。结果含对甲氧基苄醇的血液分别在室温下放置10、24 h和按“2.1”样品处理方法得到的样品室温下放置24 h后的数据与0时测得的结果进行比较，样品在上述条件下是稳定的，见表4。
2.3 天麻成分对甲氧基苄醇在大鼠血液中的药代动力学参数
采用DAS3.0软件进行数据处理，绘制药物浓度-时间曲线，见图2。对甲氧基苄醇的药代动力学参数以非房室模型统计矩计算，见表5。天麻成分对甲氧基苄醇的绝对生物利用度为35.5%。
3 讨论
随着分析技术的发展，色谱技术在进样方式、分离模式、检测技术及适用对象等方面也得到迅速发展，是药代动力学研究中不可缺少的一项技术[3]。HPLC是研究生物样品及其代谢产物非常重要的方法，不受样品挥发性的约束，适用范围非常广，分离效率高而且组分容易回收，稳定性好，灵敏度高，是目前药代动力学研究中常用的分析方法。建立稳定、精确的对甲氧基苄醇专属HPLC测定方法是对甲氧基苄醇在血液中药代动力学参数检测的前提条件，也是检测过程的方法学保障。
静脉注射给药时，药物直接迅速进入血液而不受吸收的影响[4]。因此，可以单纯研究对甲氧基苄醇在血液中的变化情况，不受其他影响因素的干扰。由于其他给药方式指标成分需经过许多复杂的过程才会进入血液，如果仅有微量药物进入血液，再经过多个步骤的样品处理，可能会导致在血液中检测不到目标成分[5]。静脉注射给药对于首次研究对甲氧基苄醇在血液中的变化情况有积极的意义，对甲氧基苄醇直接静脉给药可以明确得知血液中肯定含有该成分，在确定样品处理方法的时候操作难度就会减小，可以得到更为优化、精确的实验体系和方法[6-7]。
口服给药是常用的给要途径，其吸收部位是胃肠道，影响因素有很多，如药物本身的理化性质和胃肠功能等。天麻的使用方法主要为口服给药，研究灌胃给药后大鼠血液中对甲氧基苄醇的药代动力学参数可以为天麻成分对甲氧基苄醇的临床应用提供可靠的依据，包括对甲氧基苄醇给药时间间隔、药物在血液中的变化过程等。
参考文献：
[1] 杨园，杜鹏，陈勇，等.不同剂量天麻提取物中天麻素在大鼠体内的药动学研究[J].中医药学报，2010，38（5）：94-97.
[2] 罗军，吴中亮，王惠先.天麻素注射液人体药动学的研究[J].解放军药学学报，2006，22（5）：391-393.
[3] Lin HS， Zhang W， Go ML， et al. Determination of Z-3，5，4'- trimethoxystilbene in rat plasma by a simple HPLC method：application in a pre-clinical pharmacokinetic study[J]. J Pharm Biomed Anal，2010，53（3）：693-697.
[4] Haug KG， Weber B， Hochhaus G， et al. Nonlinear pharmacokinetics of visnagin in rats after intravenous bolus administration[J]. Eur J Pharm Sci，2012，45（1/2）：79-89.
[5] Xie Y， Zhong G， He H， et al. Pharmacokinetics， tissue distribution and excretion of porcine fibrinogen after intraperitoneal injection of a porcine-derived fibrin glue to rats[J]. J Pharm Biomed Anal，2011，54（1）：148-153.
[6] Kreil VE， Ambros L， Montoya L， et al. Pharmacokinetics of sodium and trihydrate amoxicillin after intravenous and intramuscular administration in llamas （Lama glama）[J]. Small Ruminant Research， 2012，102（2/3）：208-212.
[7] Chen J， Xiao HL， Hu RR， et al. Pharmacokinetics of brucine after intravenous and oral administration to rats[J]. Fitoterapia， 2011，82（8）：1302-1308.
（收稿日期：2014-11-25；编辑：陈静）