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【摘要】 目的：通过不同强度运动对去卵巢大鼠血清中OPG、RANKL和IGF-1表达的影响，探讨运动对去卵巢骨质疏松症的影响机制。方法：将大鼠随机分为正常对照组、假手术组、骨质疏松模型组、30 min运动组和60 min运动组，运动组持续训练8周。处死大鼠，取血清进行测试。结果：与正常对照组比较，8周训练后，骨质疏松模型组和30 min运动组大鼠体重显著增加（P<0.05），而60 min运动组大鼠体重增加不明显。此外，与正常对照组比较，骨质疏松模型组大鼠的OPG、IGF-1的表达明显降低，RANKL表达明显升高（P<0.01）。60 min运动组的OPG和IGF-1的水平与骨质疏松模型组大鼠比较有显著升高（P<0.01），30 min运动组大鼠的OPG也有升高（P<0.05）。结论：运动对去卵巢大鼠破骨细胞分化传导通路OPG、RANKL的表达有一定调节作用，IGF-1可能参与了对OPG的调节，并对去卵巢所致大鼠骨质疏松症有一定的防治作用。
【关键词】 骨质疏松； 运动； OPG； RANKL； IGF-1
骨质疏松症（osteoporosis）是指由于绝经或年老所致的骨质疏松症，其病理特征是骨组织所有骨的显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例地不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险度升高。我国目前已有9000多万骨质疏松症患者，总患病率为12.4%，其中骨折发生率为27.5%～32.6%。随着老龄化社会的到来，该病发病率呈逐年上升之势。绝经后妇女由于卵巢分泌雌激素减少，骨代谢紊乱，常可引起骨质疏松症发生。运动作为一种良性的刺激，可以改善和调节骨的代谢。本研究通过建立去卵巢骨质疏松大鼠模型，采用不同强度的跑台训练，研究运动对大鼠骨代谢机制的影响，为防治绝经后骨质疏松的细胞分子机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 选取3月龄清洁级雌性Sprague-Dawley大鼠60只（由徐州医学院实验动物中心提供），体重（240±15）g，大鼠按体重分层随机分为五组：正常对照组、假手术组、骨质疏松模型组、中等负荷（30 min）运动组、大负荷（60 min）运动组，每组12只。每笼5只，饲养笼选用塑料制品，并配用不锈钢罩，玻璃吸水瓶和不锈钢吸水管，饲养温度21～24 ℃。国家标准固定混合饲料喂养，自由饮食。
1.2 实验方法及指标测定
1.2.1 卵巢切除方法 假手术组行假手术，按体重腹腔注射10%水合氯醛麻醉，行背部肋下入路，将双侧卵巢提出腹腔，不切除，然后放回腹腔缝合切口，安静状态下常规喂养，不进行运动训练。骨质疏松模型组、30 min运动组和60 min运动组行去卵巢术，按假手术组方法找出双侧卵巢并将其切除。
1.2.2 运动方法 30 min运动组：切除卵巢1周后进行适应性跑台训练，开始10 min/次，适应后30 min/次，5次/周，共进行8周。60 min运动组：跑台条件与30 min运动组相同，60 min/次，5次/周，共8周。正常对照组、假手术组和骨质疏松模型组正常饲养。大鼠训练用跑台购自上海继德实验教学器械厂（型号：JD-PT型）。
1.3 检测方法 全部动物在运动组大鼠末次训练后麻醉下处死。腹主动脉取血，将收集的全血室温静置2 h后，3000 r/min，离心20 min，分离血清，-80 ℃保存。血清RANK、OPG和IGF-1的Elisa试剂盒购自上海瑞齐生物科技有限公司，所有指标的测定均根据试剂盒操作要求进行。
1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验前后大鼠体重变化的比较 大鼠训练前，各组大鼠体重无明显差异。经过8周训练后，骨质疏松模型组大鼠和30 min运动组大鼠的体重与正常对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 实验前后大鼠血清中OPG、RANKL和IGF-1含量的比较 8周运动训练后，骨质疏松模型组大鼠血清中OPG水平低于正常组和假手术组，RANKL的分泌量高于正常对照组和假手术组，IGF-1的水平明显低于正常对照组（P<0.01）。8周运动训练后，30 min运动组大鼠除了OPG的血清含量高于骨质疏松模型组（P<0.05），RANKL和IGF-1的水平与其他组均无明显差异；60 min运动组大鼠血清中OPG和IGF-1的水平均高于骨质疏松模型组大鼠（P<0.01），RANKL则相反（P<0.01），见表2。
3 讨论
本实验结果显示，在8周以后骨质疏松模型组大鼠与正常对照组比较，体重有明显增加，这与相关研究结果一致[1-2]。其原因可能是卵巢摘除后，血中雌激素水平降低，肾上腺分泌雌酮，在脂肪组织中加速转化为雌激素以弥补血中不足，引起体内脂质代谢失常，脂肪堆积造成肥胖[3]。30 min运动组的大鼠体重与假手术组比较有明显增加，这可能与运动负荷不够有关。
骨质疏松是一种由骨重建过程失衡导致，主要病理表现为松质骨骨小梁变细、断裂和数量减少，皮质骨多孔，骨质结构紊乱。骨组织结构的这些病理改变不仅使骨量减少，且使骨质量下降，明显影响骨的机械功能，致生物力学性能降低。有证据显示女性的骨量丢失开始于绝经前2～3年，随着雌激素分泌的不断减少在绝经后加剧，这个过程将持续5～10年[4-5]。OPG/RANKL/RANK系统在破骨细胞激活、生成、分化和成熟的过程中起着决定性作用，是非常重要的破骨细胞分化调节通路[6]。大鼠去卵巢后，雌激素分泌量减少，骨的吸收增加，骨形成减少。骨保护素（OPG）是RANKL/RANK信号通路的内源性调节因子，OPG广泛分布于人和动物的多种组织细胞中，许多细胞如骨髓间质细胞、成骨细胞、成纤维细胞、主动脉平滑肌细胞、成骨肉瘤细胞等均可分泌OPG，其可与过量的RANKL结合，防止RANK活化，抑制破骨细胞活性[7]。OPG的表达受多种代谢调控因子的调节，如IL-1、TNF-α、TGF-β等能增加破骨细胞的表达，而各种刺激骨吸收的因子如由PTH通过促进成骨细胞表达RANKL，降低表达OPG介导的[8]。RANKL是破骨细胞前体细胞分化为成熟破骨细胞的必需因子，可促进破骨细胞分化，增强成熟破骨细胞活力，阻止破骨细胞凋亡。RANKL主要由骨髓间质细胞和成骨细胞分泌，破骨细胞不分泌RANKL。RANKL的受体RANK 是一种跨膜蛋白，主要存在于骨髓巨噬细胞的表面[9-10]。运动可以改善血液OPG/RANKL的比例，影响成骨细胞和破骨细胞数目或活性，导致骨结构改变。有实验研究表明，250 km超长距离跑后第3天，血清破骨细胞分化因子（RANKL）和OPG水平较运动前有所上升[11]。此外，正向研究还发现雌激素可通过调节EphB4/EphrinB2信号通路抑制破骨细胞分化，说明雌激素对骨破坏有抑制作用[12]，李丽辉等[13]的研究也表明3个月的持续运动，去卵巢大鼠骨组织的OPGmRNA的表达显著高于模型组大鼠。何淑敏等[14]通过对生长期大鼠进行12周的耐力性运动训练，结果显示OPG水平高于对照组。本实验中8周实验后，骨质疏松模型组大鼠的OPG含量明显低于正常对照组，而60 min运动组大鼠血清OPG的含量明显高于骨质疏松模型组，RANKL的水平低于骨质疏松模型组（P<0.01），其机制可能是规律性的运动训练提高OPG的分泌，提高了OPG/RANKL的比例，能够改善大鼠由于去卵巢而导致的骨质疏松症状。30 min运动组的大鼠8周运动训练后，OPG的水平高于骨质疏松模型组（P<0.05），而RANKL的分泌量与模型组差异不显著，这可能与运动的负荷有关。 IGF-1是骨骼中含量最丰富的生长因子之一，是包括成骨细胞在内多种细胞的促有丝分裂剂，它以自分泌和旁分泌的形式调节骨骼细胞的功能，促进成骨细胞增殖、分化和募集，抑制细胞凋亡，刺激骨胶原的转录和DNA合成，抑制胶原的降解，增加骨基质沉积。Thomas等[15]使用IGF-1刺激体外培养的基质细胞（hBMSC，是骨髓中具有分化潜能的非造血细胞，能进一步分化为成骨细胞），发现IGF-I以及它们的受体活性类似物能显著促进hBMSC的增殖和分化。本实验中8周训练后，60 min运动组大鼠血清中IGF-1的水平高于骨质疏松模型组，并且与OPG的水平成正相关，而与RANKl的水平成负相关，说明IGF-1促进骨细胞的增长，抑制骨的吸收，其可能的机制还待进一步的研究。
参考文献
[1]李世昌， 季浏，刘体伟，等，不同方式运动对去卵巢大鼠骨密度、骨生物力学及代谢指标的影响[J].体育学刊，2012，19（2）：132-137.
[2]李长天，王雅莉，陈雁飞，等.葛根素对去卵巢大鼠体重及大脑海马CA1区CA3区神经元形态的影响[J].中国老年学杂志，2012，10（32）：4426-4428.
[3]李洪洋.去势雌鼠固执骨质疏松模型研究[J].现代预防医，1992，17（19）：1-3.
[4] Dalle Carbonare L，Valenti M T，Zanatta M，et al. Circulating esenchymal stem cells with abnormal osteogenic differentiation in patients with osteoporosis[J].Arthritis Rheum，2009，60（11）：3356-3365.
[5]王俊玲，黄思敏，梁启瑶，等.雌激素的来源及其在骨代谢中的作用[J].中国骨质疏松杂志，2015，6（21）：729-732.
[6]查小云，胡予.骨质疏松相关信号通路研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2014，20（2）：205-209.
[7]丁从珠，姚瑶，方芸，等.青藤碱对胶原诱导的关节炎大鼠血清OPG/RANKL、IL-17含量的影响[J].南京中医药大学学报，2012，28（4）：330-333.
[8] Huang J C，Sakata T，Hleger L L，et al.PTH differentially regulates expression of RANKL and OPG[J].J Bone Miner Res，2004，19（4）：235-244.
[9] Asanuma Y， Chung C P， Oeser A， et al. Serum osteoprotegerin is increased and independently associated with coronary-artery atherosclerosis in patients with rheumatoid arthritis[J]. Atherosclerosis， 2007，195（2）：e135-e141.
[10] Silva I，Branco J C. RNAK/RANKL/OPG：literature review[J].Acta Reumatol Port，2011，36（3）：209-218.
[11] Kerschan-Schindl K，Thalmann M，Sodeck G H，et al. A 246-km continuous running race causes significant changes in bone metabolism[J]. Bone，2009，45（6）：1079-1083.
[12]史淇月，杨柳，魏铂沅，等.雌激素通过调节 EphB4/EphrinB2信号参与破骨细胞分[J].中国骨质疏松杂志，2014，20（4）：347-352.
[13]李丽辉，杨杰，董洁琼，等.运动对去卵巢骨质疏松大鼠OPG、RANKL表达的影响[J].中国运动医学杂志，2013，32（11）：991-996.
[14]何淑敏，陈明.耐力训练对生长期大鼠血清OPG，sRANKL及骨代谢生化因子、骨量的影响[J].中国运动医学杂志，2010，29（5）：560-562.
[15] Thomas T，Gori F，Spolsberg T G，et al.Response of bipotential human marrow stromal cells to insulin-like factors：effect on binding protein production， proliferation and commitment to osteoblasts and adipocytes[J].Endocrinology，1999， 50（36）：5044.
（收稿日期：2015-05-12） （本文编辑：蔡元元）
【关键词】 骨质疏松； 运动； OPG； RANKL； IGF-1
骨质疏松症（osteoporosis）是指由于绝经或年老所致的骨质疏松症，其病理特征是骨组织所有骨的显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例地不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险度升高。我国目前已有9000多万骨质疏松症患者，总患病率为12.4%，其中骨折发生率为27.5%～32.6%。随着老龄化社会的到来，该病发病率呈逐年上升之势。绝经后妇女由于卵巢分泌雌激素减少，骨代谢紊乱，常可引起骨质疏松症发生。运动作为一种良性的刺激，可以改善和调节骨的代谢。本研究通过建立去卵巢骨质疏松大鼠模型，采用不同强度的跑台训练，研究运动对大鼠骨代谢机制的影响，为防治绝经后骨质疏松的细胞分子机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 选取3月龄清洁级雌性Sprague-Dawley大鼠60只（由徐州医学院实验动物中心提供），体重（240±15）g，大鼠按体重分层随机分为五组：正常对照组、假手术组、骨质疏松模型组、中等负荷（30 min）运动组、大负荷（60 min）运动组，每组12只。每笼5只，饲养笼选用塑料制品，并配用不锈钢罩，玻璃吸水瓶和不锈钢吸水管，饲养温度21～24 ℃。国家标准固定混合饲料喂养，自由饮食。
1.2 实验方法及指标测定
1.2.1 卵巢切除方法 假手术组行假手术，按体重腹腔注射10%水合氯醛麻醉，行背部肋下入路，将双侧卵巢提出腹腔，不切除，然后放回腹腔缝合切口，安静状态下常规喂养，不进行运动训练。骨质疏松模型组、30 min运动组和60 min运动组行去卵巢术，按假手术组方法找出双侧卵巢并将其切除。
1.2.2 运动方法 30 min运动组：切除卵巢1周后进行适应性跑台训练，开始10 min/次，适应后30 min/次，5次/周，共进行8周。60 min运动组：跑台条件与30 min运动组相同，60 min/次，5次/周，共8周。正常对照组、假手术组和骨质疏松模型组正常饲养。大鼠训练用跑台购自上海继德实验教学器械厂（型号：JD-PT型）。
1.3 检测方法 全部动物在运动组大鼠末次训练后麻醉下处死。腹主动脉取血，将收集的全血室温静置2 h后，3000 r/min，离心20 min，分离血清，-80 ℃保存。血清RANK、OPG和IGF-1的Elisa试剂盒购自上海瑞齐生物科技有限公司，所有指标的测定均根据试剂盒操作要求进行。
1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验前后大鼠体重变化的比较 大鼠训练前，各组大鼠体重无明显差异。经过8周训练后，骨质疏松模型组大鼠和30 min运动组大鼠的体重与正常对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 实验前后大鼠血清中OPG、RANKL和IGF-1含量的比较 8周运动训练后，骨质疏松模型组大鼠血清中OPG水平低于正常组和假手术组，RANKL的分泌量高于正常对照组和假手术组，IGF-1的水平明显低于正常对照组（P<0.01）。8周运动训练后，30 min运动组大鼠除了OPG的血清含量高于骨质疏松模型组（P<0.05），RANKL和IGF-1的水平与其他组均无明显差异；60 min运动组大鼠血清中OPG和IGF-1的水平均高于骨质疏松模型组大鼠（P<0.01），RANKL则相反（P<0.01），见表2。
3 讨论
本实验结果显示，在8周以后骨质疏松模型组大鼠与正常对照组比较，体重有明显增加，这与相关研究结果一致[1-2]。其原因可能是卵巢摘除后，血中雌激素水平降低，肾上腺分泌雌酮，在脂肪组织中加速转化为雌激素以弥补血中不足，引起体内脂质代谢失常，脂肪堆积造成肥胖[3]。30 min运动组的大鼠体重与假手术组比较有明显增加，这可能与运动负荷不够有关。
骨质疏松是一种由骨重建过程失衡导致，主要病理表现为松质骨骨小梁变细、断裂和数量减少，皮质骨多孔，骨质结构紊乱。骨组织结构的这些病理改变不仅使骨量减少，且使骨质量下降，明显影响骨的机械功能，致生物力学性能降低。有证据显示女性的骨量丢失开始于绝经前2～3年，随着雌激素分泌的不断减少在绝经后加剧，这个过程将持续5～10年[4-5]。OPG/RANKL/RANK系统在破骨细胞激活、生成、分化和成熟的过程中起着决定性作用，是非常重要的破骨细胞分化调节通路[6]。大鼠去卵巢后，雌激素分泌量减少，骨的吸收增加，骨形成减少。骨保护素（OPG）是RANKL/RANK信号通路的内源性调节因子，OPG广泛分布于人和动物的多种组织细胞中，许多细胞如骨髓间质细胞、成骨细胞、成纤维细胞、主动脉平滑肌细胞、成骨肉瘤细胞等均可分泌OPG，其可与过量的RANKL结合，防止RANK活化，抑制破骨细胞活性[7]。OPG的表达受多种代谢调控因子的调节，如IL-1、TNF-α、TGF-β等能增加破骨细胞的表达，而各种刺激骨吸收的因子如由PTH通过促进成骨细胞表达RANKL，降低表达OPG介导的[8]。RANKL是破骨细胞前体细胞分化为成熟破骨细胞的必需因子，可促进破骨细胞分化，增强成熟破骨细胞活力，阻止破骨细胞凋亡。RANKL主要由骨髓间质细胞和成骨细胞分泌，破骨细胞不分泌RANKL。RANKL的受体RANK 是一种跨膜蛋白，主要存在于骨髓巨噬细胞的表面[9-10]。运动可以改善血液OPG/RANKL的比例，影响成骨细胞和破骨细胞数目或活性，导致骨结构改变。有实验研究表明，250 km超长距离跑后第3天，血清破骨细胞分化因子（RANKL）和OPG水平较运动前有所上升[11]。此外，正向研究还发现雌激素可通过调节EphB4/EphrinB2信号通路抑制破骨细胞分化，说明雌激素对骨破坏有抑制作用[12]，李丽辉等[13]的研究也表明3个月的持续运动，去卵巢大鼠骨组织的OPGmRNA的表达显著高于模型组大鼠。何淑敏等[14]通过对生长期大鼠进行12周的耐力性运动训练，结果显示OPG水平高于对照组。本实验中8周实验后，骨质疏松模型组大鼠的OPG含量明显低于正常对照组，而60 min运动组大鼠血清OPG的含量明显高于骨质疏松模型组，RANKL的水平低于骨质疏松模型组（P<0.01），其机制可能是规律性的运动训练提高OPG的分泌，提高了OPG/RANKL的比例，能够改善大鼠由于去卵巢而导致的骨质疏松症状。30 min运动组的大鼠8周运动训练后，OPG的水平高于骨质疏松模型组（P<0.05），而RANKL的分泌量与模型组差异不显著，这可能与运动的负荷有关。 IGF-1是骨骼中含量最丰富的生长因子之一，是包括成骨细胞在内多种细胞的促有丝分裂剂，它以自分泌和旁分泌的形式调节骨骼细胞的功能，促进成骨细胞增殖、分化和募集，抑制细胞凋亡，刺激骨胶原的转录和DNA合成，抑制胶原的降解，增加骨基质沉积。Thomas等[15]使用IGF-1刺激体外培养的基质细胞（hBMSC，是骨髓中具有分化潜能的非造血细胞，能进一步分化为成骨细胞），发现IGF-I以及它们的受体活性类似物能显著促进hBMSC的增殖和分化。本实验中8周训练后，60 min运动组大鼠血清中IGF-1的水平高于骨质疏松模型组，并且与OPG的水平成正相关，而与RANKl的水平成负相关，说明IGF-1促进骨细胞的增长，抑制骨的吸收，其可能的机制还待进一步的研究。
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[2]李长天，王雅莉，陈雁飞，等.葛根素对去卵巢大鼠体重及大脑海马CA1区CA3区神经元形态的影响[J].中国老年学杂志，2012，10（32）：4426-4428.
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[4] Dalle Carbonare L，Valenti M T，Zanatta M，et al. Circulating esenchymal stem cells with abnormal osteogenic differentiation in patients with osteoporosis[J].Arthritis Rheum，2009，60（11）：3356-3365.
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[8] Huang J C，Sakata T，Hleger L L，et al.PTH differentially regulates expression of RANKL and OPG[J].J Bone Miner Res，2004，19（4）：235-244.
[9] Asanuma Y， Chung C P， Oeser A， et al. Serum osteoprotegerin is increased and independently associated with coronary-artery atherosclerosis in patients with rheumatoid arthritis[J]. Atherosclerosis， 2007，195（2）：e135-e141.
[10] Silva I，Branco J C. RNAK/RANKL/OPG：literature review[J].Acta Reumatol Port，2011，36（3）：209-218.
[11] Kerschan-Schindl K，Thalmann M，Sodeck G H，et al. A 246-km continuous running race causes significant changes in bone metabolism[J]. Bone，2009，45（6）：1079-1083.
[12]史淇月，杨柳，魏铂沅，等.雌激素通过调节 EphB4/EphrinB2信号参与破骨细胞分[J].中国骨质疏松杂志，2014，20（4）：347-352.
[13]李丽辉，杨杰，董洁琼，等.运动对去卵巢骨质疏松大鼠OPG、RANKL表达的影响[J].中国运动医学杂志，2013，32（11）：991-996.
[14]何淑敏，陈明.耐力训练对生长期大鼠血清OPG，sRANKL及骨代谢生化因子、骨量的影响[J].中国运动医学杂志，2010，29（5）：560-562.
[15] Thomas T，Gori F，Spolsberg T G，et al.Response of bipotential human marrow stromal cells to insulin-like factors：effect on binding protein production， proliferation and commitment to osteoblasts and adipocytes[J].Endocrinology，1999， 50（36）：5044.
（收稿日期：2015-05-12） （本文编辑：蔡元元）