【摘 要】
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目的 研究血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应,初步分析其分子机制.方法 采用血清饥饿处理体外培养的HaCaT细胞诱导自噬,分析血清饥饿对细胞形态和细胞活力(MTT法)的影响.透射电镜观察白噬体囊泡形成,使用Western印迹法进行白噬标志性分子LC3-Ⅰ→LC3Ⅱ转化分析和自噬关键基因Atg7的表达以及MDC染色标记自噬体囊泡.对mTOR的蛋白表达及其ser2448和ser
【机 构】
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210042南京,中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所,天津医科大学总医院皮肤科,210042南京,中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所,210042南京,中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研
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目的 研究血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应,初步分析其分子机制.方法 采用血清饥饿处理体外培养的HaCaT细胞诱导自噬,分析血清饥饿对细胞形态和细胞活力(MTT法)的影响.透射电镜观察白噬体囊泡形成,使用Western印迹法进行白噬标志性分子LC3-Ⅰ→LC3Ⅱ转化分析和自噬关键基因Atg7的表达以及MDC染色标记自噬体囊泡.对mTOR的蛋白表达及其ser2448和ser2481位点磷酸化产物水平进行分析.结果 血清饥饿HaCaT细胞活力上升,电镜观察和MDC染色发现,血清饥饿处理的HaCaT细胞中有自噬体囊泡形成.Western印迹显示,血清饥饿细胞LC3-Ⅰ→LC3Ⅱ转化(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率为3.508±0.415)较正常培养的细胞(0.538±0.038)显著上调(两组比较,t=13.32,P＜ 0.01)；白噬关键基因Atg7表达上调(对照细胞和血清饥饿细胞Atg7/GAPDH分别为0.021±0.006和0.048±0.011,f=7.27,P＜ 0.05).血清饥饿处理的细胞中,mTOR的ser2448位点、ser2481位点磷酸化产物水平显著降低(对照细胞和血清饥饿细胞间的磷酸化mTORser2448/mTOR比率分别为0.762±0.108和0.394±0.048,t=7.58,P＜ 0.05；磷酸化mTORser248 1/mTOR的比率分别为0.263±0.039和0.111±0.020,t=13.77,P＜ 0.01).结论 血清饥饿处理可以诱导HaCaT细胞发生自噬,并且导致细胞活力上升.这种白噬的诱导可能与自噬调控关键元件mTOR蛋白活化抑制相关。
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