论文部分内容阅读
本研究目的是建立稳定表达HLA-A*1101分子的K562细胞株,为研究慢性髓系白血病(CML)HLA-I限制性抗原特异T细胞的细胞毒作用提供靶细胞。利用RT-PCR从CML患者外周血单个细胞中扩增HLA-A*1101基因全长序列;利用重组PCR将2A肽连接子(D-V-E-X-N-P-G-P)基因连接到HLA-A*1101的3’端,并将其定向克隆入带有增强型绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N3,构成HLA-A*1101-T2A-EGFP转录盒的重组表达载体;利用电穿孔技术将pEGFP-N3或重组质粒转染入K562细胞,利用荧光显微镜监测绿色荧光蛋白的表达,通过G418筛选出有效转染pEGFP-N3或HLA-A*1101-T2A-EGFP载体的K 562细胞株;利用RT-PCR和流式细胞术检测HLA-A*1101基因和蛋白的表达情况。结果表明,成功构建了以2A肽基因为连接子的HLA-A*1101-T2A-EGFP真核表达载体;重组质粒转染的K562细胞经G418筛选2个月后,获得2株表达绿色荧光蛋白的K562稳定细胞株HLA-A*1101+K562和pEGFP-N3+K562。RT-PCR检测证明,HLA-A*1101+K562细胞表达HLA-A*1101基因,而pEGFP-N3+K562细胞则不表达HLA-A*1101;流式细胞术分析显示,HLA-A*1101和GFP蛋白双阳性HLA-A*1101+K562细胞占88.5%,明显高于pEGFP-N3+K562细胞(0.698%)。结论:建立了一个简单有效地筛选HLA-A*1101+K562细胞株的方法,并成功地建立了膜稳定表达HLA-A*1101蛋白的K562细胞株,为进一步研究CML的特异性细胞免疫提供工具细胞。