靶向人转录因子GLI1基因的RNAi真核表达载体的构建与鉴定

• 作 者: 郭杰芳 高军 龚燕芳 金晶 吴红玉 满晓华 李兆申
• 机 构: 200433上海,第二军医大学长海医院消化内科,200433上海,第二军医大学长海医院消化内科,200433上海,第二军医大学长海医院消化内科,200433上海,第二军医大学长海医院消化内科,2004
• 出 处: 中华胰腺病杂志
• 发表日期: 2013年13期
• 关键词: RNA interference Short hairpin RNA Transcription factor GLI1 genes Hedgehog sign

目的 利用pGCsi-U6-GFP质粒构建干扰人转录因子GLI1基因的小发夹RNA(shRNA)表达载体,并进行干扰活性鉴定.方法 根据GenBank中GLI1cDNA的序列,设计并合成3条GLI1siRNA,分别克隆至质粒载体pGCsi-U6-GFP中构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5a,扩增后提取质粒,行PCR及测序鉴定.脂质体转染法将鉴定正确的3个重组质粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3及作为阴性对照质粒的pGCsi-U6-GLI1siRNA-C分别与过表达质粒pEGFP-N1-GLI1共转染HEK293细胞株,48 h后收集细胞,半定量RT-PCR及蛋白质印迹法检测各组细胞GH1 mRNA及蛋白的表达,鉴定筛选出最佳干扰质粒.结果 3个重组质粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3均扩增出预期大小(369 bp)的片段,经测序证实与设计合成的序列完全一致.3个重组质粒转染HEK29细胞后细胞GLI1mRNA表达量分别为0.290±0.011、0.421 ±0.018、0.373±0.018,蛋白表达量分别为0.318 ±0.026、0.433±0.021、0.381±0.018,均显著低于阴性对照质粒转染细胞的0.834±0.022及0.818±0.024(P=0.000).GLI1 mRNA表达抑制率分别达65.8％、50.7％、55.7％,蛋白表达抑制率分别为63.9％、48.3％、53.9％,以pGCsi-U6-GLI1siRNA-1的干扰作用最强.结论 成功构建了靶向GLI1的shRNA表达载体,筛选出具有最佳干扰效果的质粒,为进一步研究GLI1基因功能奠定了基础。