【摘 要】
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目的 克隆、表达细粒棘球蚴EPC1(EgEPC1)基因,鉴定重组抗原的反应原性,并用棘球蚴病患者血清评价其诊断价值.方法 从绵羊肝脏棘球蚴囊中分离原头节,提取其总RNA,采用RT-PCR扩
【机 构】
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中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所,卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室,世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心,上海,200025;青海省地方病预防控制所,西宁,811602
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目的 克隆、表达细粒棘球蚴EPC1(EgEPC1)基因,鉴定重组抗原的反应原性,并用棘球蚴病患者血清评价其诊断价值.方法 从绵羊肝脏棘球蚴囊中分离原头节,提取其总RNA,采用RT-PCR扩增EgEPC1基因,将其克隆至pGEM-T载体,再将其与原核表达载体PET28a(+)连接构建重组质粒PET28a-EgEPC1,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)对纯化的重组抗原进行鉴定分析.以该重组蛋白作为包被抗原建立ELISA方法,检测细粒棘球蚴病患者血清(60份)特异性IgG抗体,同时以多房棘球蚴病(37份)、囊尾蚴病(16份)、华支睾吸虫病(7份)、日本血吸虫病(4份)患者和健康人血清(33份)作为对照,评价重组抗原EgEPC1的免疫诊断效果.结果 双酶切鉴定和测序结果均显示重组质粒PET28a-EgEPC1构建成功.SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组质粒PET28a-EgEPC1在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,产物以可溶蛋白形式存在,重组蛋白EgEPC1的相对分子质量(Mr)约为11 000,可被细粒棘球蚴病患者混合血清识别.EgEPC1对细粒棘球蚴病患者血清的诊断敏感性和特异性分别为78.3%(47/60)和98.3%(59/60),与多房棘球蚴病患者血清交叉反应阳性率为40.5%(15/37).结论 EgEPC1重组抗原对细粒棘球蚴病具有较好的诊断价值.
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