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摘 要:本研究构建了含马铃薯X病毒(PVX)衣壳蛋白(CP)基因的原核表达载体,利用在大肠杆菌内表达的马铃薯X病毒CP制备了效价为1∶1 600的抗血清。该血清可用于马铃薯、番茄、辣椒和烟草等作物携带PVX情况的检测。
关键词:马铃薯X病毒;衣壳蛋白;原核表达载体;抗血清
中图分类号:Q786 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)03-0005-03
马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)是马铃薯X病毒属(Potexvirus)的典型成员,最早由Smith于1931年在马铃薯上发现,目前在世界各地均有发生[1]。PVX侵染马铃薯引起轻型花叶或隐症,多年侵染则引起重型花叶或矮化,造成的产量损失为10%~80%。PVX在烟草上引起斑驳和坏死斑点,在番茄上引起花叶及矮化。当PVX与马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、烟草脉斑驳病毒(Tobacco vein mottling virus,TVMV)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)复合侵染时会出现协生现象,导致更大的损失。
鉴于培育和种植无病毒种苗是防治病毒病最有效的措施之一,而以酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)为主的血清学方法是目前大规模检测病毒时广泛使用的方法,本研究构建了含PVX 衣壳蛋白(CP)基因的原核表达载体,利用原核表达的PVX CP制备了抗血清。
1 材料与方法
1.1 材料
PVX分离物FX21由山东农业大学植物保护学院植物病毒研究室采自山东费县烟区,3次单斑分离纯化后摩擦接种到心叶烟上[2]。原核表达载体pET-22b(+)、大肠杆菌Escherichia coli DH5α和BL21(DE3)细胞均由山东农业大学植保学院植物病毒室保存;RNA提取试剂盒TRIzol购自博大泰克公司;克隆载体pMD18-T、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司。其它化学试剂为国产分析纯。
1.2 表达载体构建及诱导表达
采用文献[2]、[3]的方法,从发病烟草叶片中提取总RNA。以提取的总RNA为模板, 利用正向引物5′-GAGGATCCGTCAGCA′CCAGCTAGCACAAC-3′(下划线为BamHⅠ酶切序列)和反向引物5′-CGAAGCTTTTATGGTGGTGGTAGA
GTGAC-3′(下划线为Hind Ⅲ的酶切序列)进行RT-PCR,扩增PVXCP基因。PCR产物回收后与pMD18-T连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。提取质粒,经PCR扩增和酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海博亚有限公司测序。
测序证实无误的重组质粒经BamH I和Hind Ⅲ双酶切后回收PVXCP基因片段,与经相同酶切的pET-22b(+)连接,转化E. coli DH5α感受态细胞。经PCR扩增和酶切鉴定为阳性的重组质粒(pET-PVXCP)转化E. coli BL21感受态细胞。挑取单菌落接种于5 ml LB液体培养基中(含氨苄青霉素50 μg/ml),37℃活化过夜,1∶100稀释到不含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃、227 r/min培养3 h,加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度1 mmol/L,37℃继续培养3 h。离心收集菌体,加适量pH 8.0 TE溶液,振荡悬浮,再加入等体积的2×SDS上样缓冲液,100℃煮沸5 min,SDS-PAGE电泳检测表达情况。
1.3 抗血清的制备及检测
从凝胶中切取特异性表达的蛋白带,加适量生理盐水研磨后,用等量的弗氏不完全佐剂乳化。采用肌肉注射结合皮下注射免疫家兔,每隔1周免疫1次,共免疫5次。最后一次注射1周后耳静脉采血,利用间接ELISA法测定抗血清的效价[3]。收集抗血清,分装后-20℃贮存。
2 结果与分析
2.1 PVX CP基因的扩增及与质粒载体的连接
RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶分离,利用DNA回收试剂盒回收大小约为760 bp的目的片段,与pMD18-T载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将转化的大肠杆菌涂布在含100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上筛选重组质粒。可能含外源基因的重组质粒转化细胞形成的菌落为白色,无插入片段的质粒转化细胞形成的菌落为蓝色。随机挑取白色菌落进行培养,用碱裂解法提取重组质粒。经PCR扩增和酶切鉴定为阳性的重组质粒再通过测序证实序列没有错误。
2.2 大肠杆菌表达载体的构建
将经测序证实成功插入PVX CP基因的重组质粒(命名为pMD18-PVXCP)用BamHⅠ和HindⅢ酶切目的片段,电泳回收约760 bp的片段,将其与同样经BamHⅠ和HindⅢ酶切并回收的pET-22b(+)连接。热激法转化大肠杆菌BL21,37℃恒温箱培养12～16 h后可看到白色菌落。挑取单菌落培养过夜,提取质粒并用0.8%的琼脂糖电泳检测。对可能含有外源片段的质粒(pET-PVXCP)用PCR和酶切两种方法进行鉴定,结果表明,PCR和酶切得到的片段与预期大小一致(图1),原菌落可供诱导表达。
2.3 PVX CP基因的诱导表达和SDS-PAGE分析
将含有pET-PVXCP的BL21单菌落在5 ml含有氨苄青霉素的 LB培养基中培养过夜,按1∶100转入100 ml不含氨苄青霉素的培养基中培养,当OD600值达到0.6时,加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG,诱导3 h后取菌液进行分析。SDS-PAGE结果表明,在29 ku左右处有一蛋白带(图2)。本研究中表达的是PVX CP的融合蛋白,含有载体的几十个氨基酸,因而分子量比正常的25 ku大。
2.4 抗血清制备
对实验家兔进行五次免疫后,耳静脉取血,分离血清。在间接ELISA试验中,当抗血清稀释1 600倍时可以从病株汁液中检测出PVX,而当抗血清稀释3 200倍时,不能检测出PVX,说明本研究中制备的抗血清效价为1∶1 600(表1)。在SDS-琼脂免疫双扩散试验中,该抗血清与PVX毒原有沉淀反应,而与健康对照没有反应。
3 结论与讨论
本研究利用在大肠杆菌内表达的蛋白制备了马铃薯X病毒的效价为1∶1 600的抗血清。该血清可用于马铃薯、番茄、辣椒和烟草等作物携带PVX情况的检测。
ELISA是目前进行病毒大规模检测时最常用的方法。该方法快速灵敏, 但需大量高纯度的特异性抗血清。利用提纯的病毒粒子为抗原制备抗血清, 需要花费大量的人力、物力来繁殖和提纯病毒,而且不能完全排除寄主蛋白可能带来的影响。利用原核细胞表达产物为抗原制备抗血清可避免寄主蛋白的影响,但这种方法制备的抗血清往往效价较低,而且通过SDS-PAGE纯化制备的蛋白抗原可能与天然的寄主蛋白无反应。本研究中制备的PVX抗血清可与天然蛋白反应,而且已经成功用于烟草病毒的检测[4]。
参 考 文 献:
[1] Bercks R. Potato virus X. Descriptions of plant viruses, No. 4[EB/OL]. Commonwealth Mycological Institute/Association of Applied Biologists, London,1970.
[2] Yu X Q, Wang H Y, Lan Y F, et al. Complete genome sequence of a Chinese isolate of potato virus X and analysis of genetic diversity[J]. Journal of Phytopathology,2008,156:346-351.
[3] 兰玉菲, 刘金亮,高 瑞,等. 烟草脉带花叶病毒CP基因的原核表达及抗血清制备[J].植物病理学报,2007,37(5):461-466.
[4] 陈秀斋,温 亮,魏代福,等. 蒙阴烟草病毒种类检测[J].山东农业科学,2009,10:62-63.
关键词:马铃薯X病毒;衣壳蛋白;原核表达载体;抗血清
中图分类号:Q786 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)03-0005-03
马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)是马铃薯X病毒属(Potexvirus)的典型成员,最早由Smith于1931年在马铃薯上发现,目前在世界各地均有发生[1]。PVX侵染马铃薯引起轻型花叶或隐症,多年侵染则引起重型花叶或矮化,造成的产量损失为10%~80%。PVX在烟草上引起斑驳和坏死斑点,在番茄上引起花叶及矮化。当PVX与马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、烟草脉斑驳病毒(Tobacco vein mottling virus,TVMV)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)复合侵染时会出现协生现象,导致更大的损失。
鉴于培育和种植无病毒种苗是防治病毒病最有效的措施之一,而以酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)为主的血清学方法是目前大规模检测病毒时广泛使用的方法,本研究构建了含PVX 衣壳蛋白(CP)基因的原核表达载体,利用原核表达的PVX CP制备了抗血清。
1 材料与方法
1.1 材料
PVX分离物FX21由山东农业大学植物保护学院植物病毒研究室采自山东费县烟区,3次单斑分离纯化后摩擦接种到心叶烟上[2]。原核表达载体pET-22b(+)、大肠杆菌Escherichia coli DH5α和BL21(DE3)细胞均由山东农业大学植保学院植物病毒室保存;RNA提取试剂盒TRIzol购自博大泰克公司;克隆载体pMD18-T、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司。其它化学试剂为国产分析纯。
1.2 表达载体构建及诱导表达
采用文献[2]、[3]的方法,从发病烟草叶片中提取总RNA。以提取的总RNA为模板, 利用正向引物5′-GAGGATCCGTCAGCA′CCAGCTAGCACAAC-3′(下划线为BamHⅠ酶切序列)和反向引物5′-CGAAGCTTTTATGGTGGTGGTAGA
GTGAC-3′(下划线为Hind Ⅲ的酶切序列)进行RT-PCR,扩增PVXCP基因。PCR产物回收后与pMD18-T连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。提取质粒,经PCR扩增和酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海博亚有限公司测序。
测序证实无误的重组质粒经BamH I和Hind Ⅲ双酶切后回收PVXCP基因片段,与经相同酶切的pET-22b(+)连接,转化E. coli DH5α感受态细胞。经PCR扩增和酶切鉴定为阳性的重组质粒(pET-PVXCP)转化E. coli BL21感受态细胞。挑取单菌落接种于5 ml LB液体培养基中(含氨苄青霉素50 μg/ml),37℃活化过夜,1∶100稀释到不含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃、227 r/min培养3 h,加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度1 mmol/L,37℃继续培养3 h。离心收集菌体,加适量pH 8.0 TE溶液,振荡悬浮,再加入等体积的2×SDS上样缓冲液,100℃煮沸5 min,SDS-PAGE电泳检测表达情况。
1.3 抗血清的制备及检测
从凝胶中切取特异性表达的蛋白带,加适量生理盐水研磨后,用等量的弗氏不完全佐剂乳化。采用肌肉注射结合皮下注射免疫家兔,每隔1周免疫1次,共免疫5次。最后一次注射1周后耳静脉采血,利用间接ELISA法测定抗血清的效价[3]。收集抗血清,分装后-20℃贮存。
2 结果与分析
2.1 PVX CP基因的扩增及与质粒载体的连接
RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶分离,利用DNA回收试剂盒回收大小约为760 bp的目的片段,与pMD18-T载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将转化的大肠杆菌涂布在含100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上筛选重组质粒。可能含外源基因的重组质粒转化细胞形成的菌落为白色,无插入片段的质粒转化细胞形成的菌落为蓝色。随机挑取白色菌落进行培养,用碱裂解法提取重组质粒。经PCR扩增和酶切鉴定为阳性的重组质粒再通过测序证实序列没有错误。
2.2 大肠杆菌表达载体的构建
将经测序证实成功插入PVX CP基因的重组质粒(命名为pMD18-PVXCP)用BamHⅠ和HindⅢ酶切目的片段,电泳回收约760 bp的片段,将其与同样经BamHⅠ和HindⅢ酶切并回收的pET-22b(+)连接。热激法转化大肠杆菌BL21,37℃恒温箱培养12～16 h后可看到白色菌落。挑取单菌落培养过夜,提取质粒并用0.8%的琼脂糖电泳检测。对可能含有外源片段的质粒(pET-PVXCP)用PCR和酶切两种方法进行鉴定,结果表明,PCR和酶切得到的片段与预期大小一致(图1),原菌落可供诱导表达。
2.3 PVX CP基因的诱导表达和SDS-PAGE分析
将含有pET-PVXCP的BL21单菌落在5 ml含有氨苄青霉素的 LB培养基中培养过夜,按1∶100转入100 ml不含氨苄青霉素的培养基中培养,当OD600值达到0.6时,加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG,诱导3 h后取菌液进行分析。SDS-PAGE结果表明,在29 ku左右处有一蛋白带(图2)。本研究中表达的是PVX CP的融合蛋白,含有载体的几十个氨基酸,因而分子量比正常的25 ku大。
2.4 抗血清制备
对实验家兔进行五次免疫后,耳静脉取血,分离血清。在间接ELISA试验中,当抗血清稀释1 600倍时可以从病株汁液中检测出PVX,而当抗血清稀释3 200倍时,不能检测出PVX,说明本研究中制备的抗血清效价为1∶1 600(表1)。在SDS-琼脂免疫双扩散试验中,该抗血清与PVX毒原有沉淀反应,而与健康对照没有反应。
3 结论与讨论
本研究利用在大肠杆菌内表达的蛋白制备了马铃薯X病毒的效价为1∶1 600的抗血清。该血清可用于马铃薯、番茄、辣椒和烟草等作物携带PVX情况的检测。
ELISA是目前进行病毒大规模检测时最常用的方法。该方法快速灵敏, 但需大量高纯度的特异性抗血清。利用提纯的病毒粒子为抗原制备抗血清, 需要花费大量的人力、物力来繁殖和提纯病毒,而且不能完全排除寄主蛋白可能带来的影响。利用原核细胞表达产物为抗原制备抗血清可避免寄主蛋白的影响,但这种方法制备的抗血清往往效价较低,而且通过SDS-PAGE纯化制备的蛋白抗原可能与天然的寄主蛋白无反应。本研究中制备的PVX抗血清可与天然蛋白反应,而且已经成功用于烟草病毒的检测[4]。
参 考 文 献:
[1] Bercks R. Potato virus X. Descriptions of plant viruses, No. 4[EB/OL]. Commonwealth Mycological Institute/Association of Applied Biologists, London,1970.
[2] Yu X Q, Wang H Y, Lan Y F, et al. Complete genome sequence of a Chinese isolate of potato virus X and analysis of genetic diversity[J]. Journal of Phytopathology,2008,156:346-351.
[3] 兰玉菲, 刘金亮,高 瑞,等. 烟草脉带花叶病毒CP基因的原核表达及抗血清制备[J].植物病理学报,2007,37(5):461-466.
[4] 陈秀斋,温 亮,魏代福,等. 蒙阴烟草病毒种类检测[J].山东农业科学,2009,10:62-63.