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摘要：目的：探讨三种坡度的跑台运动对生长期大鼠股骨超微结构的影响，为运动健骨提供理论依据。方法： 20只2月龄SD雄性大鼠随机分成对照组、水平跑组、下坡跑组（坡度-8°）和上坡跑组（坡度8°）。运动组大鼠以25 m/min运动， 50 min/d，每周5 d，共12周。训练结束后剥离大鼠股骨进行Micro-CT掃描，对骨松质骨微结构相关参数定量检测。结果：与对照组相比，各运动组大鼠股骨松质骨骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）及骨小梁数量（Tb.N）均增加；骨表面积和骨体积比（BS/BV）、骨小梁模式因子（Tb.Pf）均下降；骨小梁分离度（Tb.Sp）除上坡组略升高之外，其他各组均有下降趋势。结论：在运动时间和跑速相同的情况下，水平跑利于增加骨小梁数量；下坡跑比上坡跑利于增加骨小梁厚度。
关键词：跑台；生长期大鼠；股骨；超微结构
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2015）06-0059-04
峰值骨量（Peak Bone Mass，PBM）的充分蓄积可延缓老年期骨量的丢失，预防骨质疏松症。青春期是骨骼发育的关键时期，除了遗传和营养外，青春期参与运动是主动改善骨微结构，进而提高峰值骨量的重要方式，运动不当则适得其反。骨微结构是骨脆性的决定因素，独立于骨密度而起作用。目前，不同运动对骨微观结构影响及运动健骨中骨微结构的变化规律和特征的研究尚不完善；仅依靠骨密度和骨矿含量的数值变化并不能完整反映骨的力学强度变化特点。而运动所致的骨微结构改变——骨质空间建构的变化规律以及骨小梁之间结构特点具有运动方式和运动强度的差异。因此，对运动影响骨小梁微结构的全方位研究，成为运动与骨健康研究的关键。微焦点计算机断层扫描（micro-computed tomography，micro-CT）的空间分辨率在100 μm以下，可以全面立体地测量骨微结构、评价骨质量。本文以2月龄雄性SD大鼠为研究对象，利用micro-CT对大鼠股骨进行研究，探讨不同水平的跑台运动对改善生长期大鼠骨微结构的作用，为提高运动指导青少年体育锻炼的科学性，从而预防骨质疏松提供理论依据。
1材料与方法
1.1动物分组
2月龄雄性SD大鼠20只，体重247.9±7.997克[中国医学科学院医学实验动物研究所SCXK（京）2009-0004]。动物单笼饲养，自由进食、饮水，以国家标准啮齿类动物常规饲料喂养。环境温度18℃～24℃相对湿度45%～55%，每天光照时间12小时，大鼠饲养笼具、饮水瓶定期消毒，使用垫料均经高压灭菌。适应性喂养2天后随机分为4组：对照组（n=5）、水平跑组（n=5）、上坡跑组（n=5）和下坡跑组（n=5）。
1.2运动方案
参照Bedford[1]运动负荷的制定标准制定运动方案。
安静组不做任何特殊处理。水平跑组在第1周从10 m/min，10 min/d ，逐渐增加到15 m/min，30 min/d ；第2周逐渐增加到15 m/min，40 min/d；第3周逐渐增加到20 m/min，50 min/d；第4周逐渐增加到25 m/min，50 min/d，以后保持这一强度至第12周，每周运动5 d。上坡组前4周坡度依次为0°，5°，5°，8°，以后保持8°至第12周；跑速同水平组。下坡组前4周坡度依次为0°，-5°，-5°，-8°，以后保持-8°至第12周；跑速同水平组。
1.3组织获取
最后一次运动训练结束24小时后大鼠被处死，剥离右侧股骨，-80℃冰冻备用。
1.4micro-CT扫描
用Skyscan1076显微CT扫描，将解冻好的股骨沿长轴平行于扫描床长轴放置，对距股骨远端2 cm的区域扫描，扫描参数：电压70 kV，电流141 μA，曝光时间600 ms，平面分辨率808×788，像素点尺寸12 μm×12 μm，层间距18 μm。扫描完成后，进行组织重建。兴趣区定位于股骨远端生长板刚消失后开始上方100层的区域范围内（见图1）。以计算机自动生成阈值，提取图像信息，完成图像二值化。以micro-CT自带Version 2. 6 （build 5）软件进行定量分析，获得大鼠股骨松质骨骨微结构参数 ：骨 体 积 分 数（bone volume/total volume， BV/TV，%）、骨表面积和体积比（bone surface area/bone volume，BS/BV，μm-1）、骨小梁厚度（trabecularthickness，Tb.Th，μm）、骨小梁数量（trabeculae num-ber，Tb.N，μm-1）、骨小梁分离度（trabecular spacing，Tb.Sp，μm）、骨小梁模式因子（trabeculae patternfactor，Tb.Pf，μm-1）。
1.5数据分析（Morphological Data Analysis）
使用spss11.1对数据进行分析。所有数据采用平均值±SD表示，不同组别指标之间差异采用 ONE WAY-ANOVA 统计分析，P<0.05表示差异具有显著性，P<0.01表示差异具有非常显著性。
2结果
各组大鼠股骨远端micro-CT骨扫描的二维切片图（见图2）。由图2可见水平跑组骨小梁排列密集，骨小梁数多、间隔小，骨小梁断裂少；下坡组次之；上坡组和对照组骨小梁密集度相似并排在前二者之后。
各组大鼠股骨远端骨松质骨微结构3D结构参数（见表1）。由表1可见，与对照组相比，各运动组大鼠股骨远端骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）及骨小梁数量（Tb.N）均增加，在运动组中的变化趋势为水平组>上坡组>下坡组；其中在增加骨小梁厚度方面水平组与下坡组不具有显著差异，但二者与对照组间存在显著性差异（P<0.05），上坡组与对照组不存在显著性差异；在骨体积分数方面除水平组与对照[LL]组间存在显著性差异（P<0.05）外，其他各组间的差异均不具有统计学意义；在增加骨小梁数量方面各组间均不存在显著差异。与对照组相比，各运动组大鼠股骨远端的骨表面积和骨体积比（BS/BV）、骨小梁模式因子（Tb.Pf）分别下降，在运动组的变化趋势是水 平组>上坡组>下坡组，且水平组与对照组和上坡组在上二者中均存在显著差异（P<0.05）；下坡组与对照组在BS/BV存在显著性差异（P<0.05），上坡组与对照组均不存在显著性差异；骨小梁分离度（Tb.Sp）除上坡组略升高之外，其他各组均有下降趋势。
C：对照组股骨远端2D图；L：水平组股骨远端2D图；U：上坡组股骨远端2D图；D：下坡组股骨远端2D图。
3討论
骨质疏松症是随年龄增长而发生的生理性退行性病变，是中老年最常见的慢性骨骼疾病。其发病率已跃居全世界各种常见病的第7位，给社会和家庭带来很大负担。PBM的充分蓄积可延缓老年期骨量的丢失，预防骨质疏松症。青春期是骨骼发育的关键时期，除了遗传和营养外，青春期参与运动是主动改善骨强度，进而提高PBM的重要方式。
不同运动方式和运动强度对骨质的影响不同，适度的运动促进骨质健康，运动不当则适得其反[2-4]。据研究，运动通过影响骨组织微细结构，最终影响峰值骨量的积累；其中对富含松质骨的股骨的影响最为明显。骨的力学强度增加是骨质改善的本质特征，骨的力学特点取决于骨微细结构、骨有机基质、矿物成分、微小损伤及修复状态[5-6]。研究发现，除骨量外，骨小梁的结构变化对骨强度起着重要作用[7]。骨微结构主要包括皮质骨厚度及其内孔隙的密度，松质骨的形状、厚度、连接性及各向异性程度。骨微结构是骨脆性的决定因素，独立于骨密度而起作用[8]。仅仅依靠骨密度和骨矿含量的数值变化并不能完整反映骨的力学强度变化特点，而目前对于骨力学强度变化的研究基本是依靠生物力学的测试来实现，生物力学测试又是基于骨骼为刚体的假设而设计，显然存在诸多片面性。
在骨小梁结构研究中，传统骨组织形态计量学被誉为骨组织微结构量化分析的金标准[9]。但此种检测方法会破坏骨的完整性，且评价骨小梁的二维微结构受到评价人员技术水平的限制。micro-CT是指空间分辨率达到100 um-1um的医学CT。在扫描同时，可进行图像重建，几分钟即可完成。高分辨率（可达几微米量级）使其在松质骨小梁的微观结构和生物力学分析中得以越来越广泛的应用。
本文采用相同跑速的水平跑、上坡跑和下坡跑做为运动模型，研究不同运动强度和不同应力刺激对生长期雄性SD大鼠骨结构的影响。众所周知，Tb.Th和Tb.N下降及Tb.Sp增加是骨质疏松的表现。而本研究结果显示水平跑、上坡跑和下坡跑训练后生长期大鼠松质骨BV/TV和Tb.Th明显增加和Tb.Pf明显下降，提示骨小梁由杆状向板状变化，骨小梁数目增加同时骨小梁厚度显著增加，Tb.Sp在水平组和下坡组有下降趋势，这些数据揭示了适当的运动后成骨作用加强，这与以往文献研究结果相同[5，11]。本研究结果还显示在本研究采用的跑速情况下上坡跑对改善骨微结构的作用最小，可能与三种水平的跑台运动中上坡跑的运动强度较大有关，接近了运动能够改善骨结构的运动强度极限。有研究表明，上坡跑和下坡跑的跑速与时间相同，而跑动过程中骨组织所受到的应力不同，因而导致骨量差异[8]，本研究结果进一步证明相同跑速与时间的下坡跑比上坡跑更利于增加骨小梁厚度。Inccogu s等[12]用micro-CT研究腰椎骨椎弓根的骨小梁结构时发现引起骨小梁结构改变的可以是骨体积改变而不是骨量的丢失。故研究骨小梁微结构对于骨骼重建具有指导意义。在我们的研究中BV/TV增加，而BS/BV有下降趋势，Tb.Th增加说明在适当运动强度和不同应力作用下，骨的重建促进了生长期大鼠骨微结构的改善；为优化促进少年儿童骨质健康的运动方案提供形态计量学方面的理论依据。
参考文献：[HT5"SS]
[1]Bedford TG， Tipton CM， Wilson NC，et al.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J].Appl Physiol，1979，47（6）：1278-1283.
[2]Joo YI， Sone T，Fukunaga M， Lim SG，et al.Effects of endurance exercise on three-dimensional trabecular bone microarchitec[LL]
[HJ2.4mm]ture in young growing rats[J].Bone，2003，33（4）：485-93.
[3][JP2]Huang T H，Chang F L，Lin S C，at el.Endurance treadmill running training benefits the biomaterial quality of bone in growing male Wistar rats[J]. J Bone Miner Metab，2008，26（4）： 350-357.[JP]
[4]李忠厚，主编.骨质疏松学[M].第10版.北京：科学出版社，1998.
[5]杨涵，卜淑敏，谢金珍，沈静. Micro_CT检测中等强度跑台运动对去卵巢大鼠腰椎微结构的影响[J].中国实验动物学报，2013，21（4）：68-71.
[6]许豪文.运动生物化学概论[M].北京：高等教育出版社，2001：30.
[7]Drinkwater BL， Nilson K，Chesnut CH，et al.Bone mineral content of amenorrhoeic and eumenorrhoeic athletes[J].Nengl J Med，1984，311（5）：277 -281.
[8] Reinking MF， Alexander L E. Prevalence of Disordered-Eating Behaviors in Undergraduate Female Collegiate Athletes and Nonathletes[J]. J.Athl.Train，2005， 40（1）：47-51.
[9] Khan KM， Ambrose T L， Sran MM，et al.New criteria for female athlete triad syndrooe[J].Br J Sports Med， 2002，36（l）：10-13.
[10] Cortet B， Colin D， Dubois P，et al.Methods for quantitative analysis of trabecular bone strueture[J].Rev Rhum Engl ED，1995，62（11）：781-793.
[11] Yong IJ， Teruki S， Kazuhiro O，et al.Differential effects of jump versus running exercise on trabecular architecture during remobilization after suspension-induced osteopenia in growing rats[J]. Appl Physiol，2012，112（5）：766-72.
[12] Inccogu s，Burghardt A， Akbay A，et al.Trabecular architecture of lumbar vertebral pedicle[J].Spine，2005，30：1485-1490.
关键词：跑台；生长期大鼠；股骨；超微结构
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2015）06-0059-04
峰值骨量（Peak Bone Mass，PBM）的充分蓄积可延缓老年期骨量的丢失，预防骨质疏松症。青春期是骨骼发育的关键时期，除了遗传和营养外，青春期参与运动是主动改善骨微结构，进而提高峰值骨量的重要方式，运动不当则适得其反。骨微结构是骨脆性的决定因素，独立于骨密度而起作用。目前，不同运动对骨微观结构影响及运动健骨中骨微结构的变化规律和特征的研究尚不完善；仅依靠骨密度和骨矿含量的数值变化并不能完整反映骨的力学强度变化特点。而运动所致的骨微结构改变——骨质空间建构的变化规律以及骨小梁之间结构特点具有运动方式和运动强度的差异。因此，对运动影响骨小梁微结构的全方位研究，成为运动与骨健康研究的关键。微焦点计算机断层扫描（micro-computed tomography，micro-CT）的空间分辨率在100 μm以下，可以全面立体地测量骨微结构、评价骨质量。本文以2月龄雄性SD大鼠为研究对象，利用micro-CT对大鼠股骨进行研究，探讨不同水平的跑台运动对改善生长期大鼠骨微结构的作用，为提高运动指导青少年体育锻炼的科学性，从而预防骨质疏松提供理论依据。
1材料与方法
1.1动物分组
2月龄雄性SD大鼠20只，体重247.9±7.997克[中国医学科学院医学实验动物研究所SCXK（京）2009-0004]。动物单笼饲养，自由进食、饮水，以国家标准啮齿类动物常规饲料喂养。环境温度18℃～24℃相对湿度45%～55%，每天光照时间12小时，大鼠饲养笼具、饮水瓶定期消毒，使用垫料均经高压灭菌。适应性喂养2天后随机分为4组：对照组（n=5）、水平跑组（n=5）、上坡跑组（n=5）和下坡跑组（n=5）。
1.2运动方案
参照Bedford[1]运动负荷的制定标准制定运动方案。
安静组不做任何特殊处理。水平跑组在第1周从10 m/min，10 min/d ，逐渐增加到15 m/min，30 min/d ；第2周逐渐增加到15 m/min，40 min/d；第3周逐渐增加到20 m/min，50 min/d；第4周逐渐增加到25 m/min，50 min/d，以后保持这一强度至第12周，每周运动5 d。上坡组前4周坡度依次为0°，5°，5°，8°，以后保持8°至第12周；跑速同水平组。下坡组前4周坡度依次为0°，-5°，-5°，-8°，以后保持-8°至第12周；跑速同水平组。
1.3组织获取
最后一次运动训练结束24小时后大鼠被处死，剥离右侧股骨，-80℃冰冻备用。
1.4micro-CT扫描
用Skyscan1076显微CT扫描，将解冻好的股骨沿长轴平行于扫描床长轴放置，对距股骨远端2 cm的区域扫描，扫描参数：电压70 kV，电流141 μA，曝光时间600 ms，平面分辨率808×788，像素点尺寸12 μm×12 μm，层间距18 μm。扫描完成后，进行组织重建。兴趣区定位于股骨远端生长板刚消失后开始上方100层的区域范围内（见图1）。以计算机自动生成阈值，提取图像信息，完成图像二值化。以micro-CT自带Version 2. 6 （build 5）软件进行定量分析，获得大鼠股骨松质骨骨微结构参数 ：骨 体 积 分 数（bone volume/total volume， BV/TV，%）、骨表面积和体积比（bone surface area/bone volume，BS/BV，μm-1）、骨小梁厚度（trabecularthickness，Tb.Th，μm）、骨小梁数量（trabeculae num-ber，Tb.N，μm-1）、骨小梁分离度（trabecular spacing，Tb.Sp，μm）、骨小梁模式因子（trabeculae patternfactor，Tb.Pf，μm-1）。
1.5数据分析（Morphological Data Analysis）
使用spss11.1对数据进行分析。所有数据采用平均值±SD表示，不同组别指标之间差异采用 ONE WAY-ANOVA 统计分析，P<0.05表示差异具有显著性，P<0.01表示差异具有非常显著性。
2结果
各组大鼠股骨远端micro-CT骨扫描的二维切片图（见图2）。由图2可见水平跑组骨小梁排列密集，骨小梁数多、间隔小，骨小梁断裂少；下坡组次之；上坡组和对照组骨小梁密集度相似并排在前二者之后。
各组大鼠股骨远端骨松质骨微结构3D结构参数（见表1）。由表1可见，与对照组相比，各运动组大鼠股骨远端骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）及骨小梁数量（Tb.N）均增加，在运动组中的变化趋势为水平组>上坡组>下坡组；其中在增加骨小梁厚度方面水平组与下坡组不具有显著差异，但二者与对照组间存在显著性差异（P<0.05），上坡组与对照组不存在显著性差异；在骨体积分数方面除水平组与对照[LL]组间存在显著性差异（P<0.05）外，其他各组间的差异均不具有统计学意义；在增加骨小梁数量方面各组间均不存在显著差异。与对照组相比，各运动组大鼠股骨远端的骨表面积和骨体积比（BS/BV）、骨小梁模式因子（Tb.Pf）分别下降，在运动组的变化趋势是水 平组>上坡组>下坡组，且水平组与对照组和上坡组在上二者中均存在显著差异（P<0.05）；下坡组与对照组在BS/BV存在显著性差异（P<0.05），上坡组与对照组均不存在显著性差异；骨小梁分离度（Tb.Sp）除上坡组略升高之外，其他各组均有下降趋势。
C：对照组股骨远端2D图；L：水平组股骨远端2D图；U：上坡组股骨远端2D图；D：下坡组股骨远端2D图。
3討论
骨质疏松症是随年龄增长而发生的生理性退行性病变，是中老年最常见的慢性骨骼疾病。其发病率已跃居全世界各种常见病的第7位，给社会和家庭带来很大负担。PBM的充分蓄积可延缓老年期骨量的丢失，预防骨质疏松症。青春期是骨骼发育的关键时期，除了遗传和营养外，青春期参与运动是主动改善骨强度，进而提高PBM的重要方式。
不同运动方式和运动强度对骨质的影响不同，适度的运动促进骨质健康，运动不当则适得其反[2-4]。据研究，运动通过影响骨组织微细结构，最终影响峰值骨量的积累；其中对富含松质骨的股骨的影响最为明显。骨的力学强度增加是骨质改善的本质特征，骨的力学特点取决于骨微细结构、骨有机基质、矿物成分、微小损伤及修复状态[5-6]。研究发现，除骨量外，骨小梁的结构变化对骨强度起着重要作用[7]。骨微结构主要包括皮质骨厚度及其内孔隙的密度，松质骨的形状、厚度、连接性及各向异性程度。骨微结构是骨脆性的决定因素，独立于骨密度而起作用[8]。仅仅依靠骨密度和骨矿含量的数值变化并不能完整反映骨的力学强度变化特点，而目前对于骨力学强度变化的研究基本是依靠生物力学的测试来实现，生物力学测试又是基于骨骼为刚体的假设而设计，显然存在诸多片面性。
在骨小梁结构研究中，传统骨组织形态计量学被誉为骨组织微结构量化分析的金标准[9]。但此种检测方法会破坏骨的完整性，且评价骨小梁的二维微结构受到评价人员技术水平的限制。micro-CT是指空间分辨率达到100 um-1um的医学CT。在扫描同时，可进行图像重建，几分钟即可完成。高分辨率（可达几微米量级）使其在松质骨小梁的微观结构和生物力学分析中得以越来越广泛的应用。
本文采用相同跑速的水平跑、上坡跑和下坡跑做为运动模型，研究不同运动强度和不同应力刺激对生长期雄性SD大鼠骨结构的影响。众所周知，Tb.Th和Tb.N下降及Tb.Sp增加是骨质疏松的表现。而本研究结果显示水平跑、上坡跑和下坡跑训练后生长期大鼠松质骨BV/TV和Tb.Th明显增加和Tb.Pf明显下降，提示骨小梁由杆状向板状变化，骨小梁数目增加同时骨小梁厚度显著增加，Tb.Sp在水平组和下坡组有下降趋势，这些数据揭示了适当的运动后成骨作用加强，这与以往文献研究结果相同[5，11]。本研究结果还显示在本研究采用的跑速情况下上坡跑对改善骨微结构的作用最小，可能与三种水平的跑台运动中上坡跑的运动强度较大有关，接近了运动能够改善骨结构的运动强度极限。有研究表明，上坡跑和下坡跑的跑速与时间相同，而跑动过程中骨组织所受到的应力不同，因而导致骨量差异[8]，本研究结果进一步证明相同跑速与时间的下坡跑比上坡跑更利于增加骨小梁厚度。Inccogu s等[12]用micro-CT研究腰椎骨椎弓根的骨小梁结构时发现引起骨小梁结构改变的可以是骨体积改变而不是骨量的丢失。故研究骨小梁微结构对于骨骼重建具有指导意义。在我们的研究中BV/TV增加，而BS/BV有下降趋势，Tb.Th增加说明在适当运动强度和不同应力作用下，骨的重建促进了生长期大鼠骨微结构的改善；为优化促进少年儿童骨质健康的运动方案提供形态计量学方面的理论依据。
参考文献：[HT5"SS]
[1]Bedford TG， Tipton CM， Wilson NC，et al.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J].Appl Physiol，1979，47（6）：1278-1283.
[2]Joo YI， Sone T，Fukunaga M， Lim SG，et al.Effects of endurance exercise on three-dimensional trabecular bone microarchitec[LL]
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[3][JP2]Huang T H，Chang F L，Lin S C，at el.Endurance treadmill running training benefits the biomaterial quality of bone in growing male Wistar rats[J]. J Bone Miner Metab，2008，26（4）： 350-357.[JP]
[4]李忠厚，主编.骨质疏松学[M].第10版.北京：科学出版社，1998.
[5]杨涵，卜淑敏，谢金珍，沈静. Micro_CT检测中等强度跑台运动对去卵巢大鼠腰椎微结构的影响[J].中国实验动物学报，2013，21（4）：68-71.
[6]许豪文.运动生物化学概论[M].北京：高等教育出版社，2001：30.
[7]Drinkwater BL， Nilson K，Chesnut CH，et al.Bone mineral content of amenorrhoeic and eumenorrhoeic athletes[J].Nengl J Med，1984，311（5）：277 -281.
[8] Reinking MF， Alexander L E. Prevalence of Disordered-Eating Behaviors in Undergraduate Female Collegiate Athletes and Nonathletes[J]. J.Athl.Train，2005， 40（1）：47-51.
[9] Khan KM， Ambrose T L， Sran MM，et al.New criteria for female athlete triad syndrooe[J].Br J Sports Med， 2002，36（l）：10-13.
[10] Cortet B， Colin D， Dubois P，et al.Methods for quantitative analysis of trabecular bone strueture[J].Rev Rhum Engl ED，1995，62（11）：781-793.
[11] Yong IJ， Teruki S， Kazuhiro O，et al.Differential effects of jump versus running exercise on trabecular architecture during remobilization after suspension-induced osteopenia in growing rats[J]. Appl Physiol，2012，112（5）：766-72.
[12] Inccogu s，Burghardt A， Akbay A，et al.Trabecular architecture of lumbar vertebral pedicle[J].Spine，2005，30：1485-1490.