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摘要：采用KOD酶和rTaq酶，分别通过套式PCR检测10株大肠杆菌iss基因，以探讨PCR检测大肠杆菌iss基因的缺陷及改进方法。结果表明，rTaq酶、KOD酶对大肠杆菌iss基因1次PCR检出率分别为40%、70%，套式PCR检出率分别为80%、100%；KOD酶1次PCR检出率高于rTaq酶，但未达100%，采用KOD酶套式PCR可降低大肠杆菌iss基因的漏检可能性。
关键词：PCR检测；iss基因；套式；检出率；大肠杆菌
中图分类号： S852.61 2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0069-02
收稿日期：2014-11-07
基金项目：国家自然科学青年基金（编号：31302128）。
作者简介：樊琛（1978—），女，山东聊城人，博士，副教授，主要从事病原体分子生物学、食品安全研究。E-mail：fanchen7810@126.com。iss基因（increased serum survival gene）是编码大肠杆菌补体抗性的基因，大小为309 bp，在人源、禽源大肠杆菌中皆有发现。1979年，Binns等从人源大肠杆菌ColV、I-K94质粒获得iss基因表达，能显著增强含此基因大肠杆菌对1日龄雏鸡的毒力，还能增强转化菌的血清抗性[1-2]。目前，国外相关研究者大多将iss基因检测作为大肠杆菌毒力检测的参考指标之一，以1次PCR检测结果iss 或iss-来判定iss基因在大肠杆菌中的存在情况。大肠杆菌iss基因通常采用PCR方法或DNA探针方法检测，这2种方法检测结果可能出现不符合性，即某菌株PCR检测可能为iss 而探针检测为iss-，或PCR检测为iss-而探针检测为iss [3-5]。而在实际应用中，多以PCR检测结果判定iss在大肠杆菌中的存在情况。本试验探讨PCR方法检测大肠杆菌iss基因缺陷的原因和改进方法，以提高PCR检测大肠杆菌iss基因的准确性。1材料与方法
1.1菌株及其来源
10株大肠杆菌，分别采自黑龙江省、山东省、贵州省、新疆维吾尔自治区、北京市等地的鸡场。
1.2引物合成
1.3酶类及主要生化试剂
蛋白酶K、RnaseA、rTaq酶、KOD酶、T4DNA连接酶、pMD19-T vector克隆载体及相关试剂，均购自宝泰克生物工程公司；DNA胶回收试剂盒，购自上海华舜生物工程有限公司；所用试验试剂均为分析纯。
1.4大肠杆菌DNA提取
将待测菌琼脂板划线分离，挑取平板上菌落直径2 mm的单菌落；加入40 μL裂解液（10 mmol/L Tris-Cl、pH值为7.5，1 mmol/L EDTA）和50μg/mL蛋白酶K，混匀；55 ℃温育10 min，再于80 ℃温育10 min，加80 μL灭菌三蒸水，-20 ℃保存。
1.5iss基因检测扩增反应体系
iss PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL上游和下游引物各1 μL、大肠杆菌DNA模板5 μL、灭菌三蒸水33.5 μL，rTaq酶0.5 μL，共50 μL。套式PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL 上游和下游引物各1 μL、大肠杆菌DNA模板 2 μL、灭菌三蒸水33.5 μL、rTaq酶0.5 μL，共50 μL。
1.6扩增反应程序
1.6.1rTaq酶PCR扩增反应程序97 ℃预变性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，9个循环；95 ℃ 1 min、48 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重复2次。对PCR扩增反应未得到目的片段的菌株进行套式PCR扩增反应，反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，28个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。经连接转化，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
1.6.2KOD酶PCR扩增反应程序97 ℃预变性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、68 ℃ 30 s，9个循环；95 ℃ 1 min、68 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重复1次。对PCR扩增反应未得到目的片段的菌株进行套式PCR扩增反应，反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s，28个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。同时做空白对照。经连接转化，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
2结果与分析
由表1可见，10株大肠杆菌都含有iss基因；rTaq酶1次PCR检测4株菌株为阳性，6株为阴性，检测率为40%；套式PCR检测出现特异条带，2株菌株检测为阴性，扩增出的iss基因经序列测定，其核苷酸序列符合已发表的iss基因核苷酸序列，rTaq酶套式PCR检出率为80%；KOD酶1次PCR检测7株菌株为阳性，3株为阴性，检出率为70%，但重复性上有差异，阴性、阳性菌株有所不同，套式PCR检测也出现特异条带，10株大肠杆菌都含有iss基因，检出率为100%，扩增出的iss基因经序列测定，其核苷酸序列与已发表的iss基因核苷酸序列也相符。
3结论与讨论
研究发现，iss基因在致病性大肠杆菌中的存在率要高于非致病性大肠杆菌。Johnson等对20株禽大肠杆菌进行iss基因扩增及致病性试验，结果表明，6株致病性菌株为iss基因扩增阳性，14株非致病性菌株中有11株未扩增出iss基因、3株扩增出iss基因[7]。关于iss基因的定位，近来普遍认为iss基因是定位在ColV质粒上。有研究表明，在产生大肠菌素V（colicin V）的菌株中，人血液中有95.5%的菌株携带iss基因，肠道中有68.8%的菌株携带iss基因；禽源大肠杆菌iss基因与ColV同时出现的概率很高，iss基因很可能与ColV质粒连在一起[8-9]。大肠杆菌ColV质粒是低拷贝的大质粒[10-11]。本试验PCR所用模板为菌体经蛋白酶K消化后的粗提物，菌体消化程度可能影响PCR扩增效率，采用常规质粒提取及大质粒提取方法均未获得ColV质粒。另外，由于ColV质粒在各菌株中的拷贝数可能有所差异，也会导致ColV质粒极低拷贝的菌株在1次PCR时未能扩增出目的条带。 试验结果表明，rTaq酶与KOD酶1次PCR时，iss基因的检出率分别为40%、70%，套式PCR检出率分别为80%、100%，KOD酶检测大肠杆菌iss基因的检出率均高于rTaq酶，KOD酶对大肠杆菌iss基因扩增效率优于rTaq酶。在重复性方面，KOD酶1次PCR检测10株菌株中有2株菌株出现差异，可能与模板制备中菌体消化裂解程度及操作误差有关；KOD酶套式PCR结果无差异，采用KOD酶套式PCR检测能降低大肠杆菌iss基因的漏检率。
参考文献：
[1]Tivendale K A，Noormohammadi A H，Allen J L，et al. The conserved portion of the putative virulence region contributes to virulence of avian pathogenic Escherichia coli[J]. Microbiology，2009，155（2）： 450-460.
[2]Ozawa M，Harada K，Kojima A，et al. Antimicrobial susceptibilities，serogroups，and molecular characterization of avian pathogenic Escherichia coli isolates in Japan[J]. Avian Diseases，2008，52（3）： 392-397.
[3]Skyberg J A，Johnson T J，Johnson J R，et al. Acquisition of avian pathogenic Escherichia coli plasmids by a commensal E. coli isolate enhances its abilities to kill chicken embryos，grow in human urine，and colonize the murine kidney[J]. Infection and Immunity，2006，74（11）： 6287-6292.
[4]樊琛，王亚君，李一经. iss基因与鸡大肠杆菌毒力相关性的分析[J]. 畜牧兽医学报，2005，36（1）：58-61.
[5]Johnson T J，Wannemuehler Y，Doetkott C，et al. Identification of minimal predictors of avian pathogenic Escherichia coli virulence for use as a rapid diagnostic tool[J]. Journal of Clinical Microbiology，2008，46（12）： 3987-3996.
[6]樊琛，程霜，刘桂芹，等. 鸡大肠杆菌iss毒力基因研究进展[J]. 江苏农业科学，2014，42（8）：53-54，128.
[7]Johnson T J，Wannemuehler Y M，Nolan L K. Evolution of the iss gene in Escherichia coli[J]. Applied and Environmental Microbiology，2008，74（8）： 2360-2369.
[8]Oguttu J W，Veary C M，Picard J A. Antimicrobial drug resistance of Escherichia coli isolated from poultry abattoir workers at risk and broilers on antimicrobials[J]. Journal of the South African Veterinary Association，2008，79（4）： 161-166.
[9]Chuba P J，Leon M A，Banerjee A，et al. Cloning and DNA sequence of plasmid determinant iss，coding for increased serum survival and surface exclusion，which has homology with lambda DNA[J]. Molecular
关键词：PCR检测；iss基因；套式；检出率；大肠杆菌
中图分类号： S852.61 2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0069-02
收稿日期：2014-11-07
基金项目：国家自然科学青年基金（编号：31302128）。
作者简介：樊琛（1978—），女，山东聊城人，博士，副教授，主要从事病原体分子生物学、食品安全研究。E-mail：fanchen7810@126.com。iss基因（increased serum survival gene）是编码大肠杆菌补体抗性的基因，大小为309 bp，在人源、禽源大肠杆菌中皆有发现。1979年，Binns等从人源大肠杆菌ColV、I-K94质粒获得iss基因表达，能显著增强含此基因大肠杆菌对1日龄雏鸡的毒力，还能增强转化菌的血清抗性[1-2]。目前，国外相关研究者大多将iss基因检测作为大肠杆菌毒力检测的参考指标之一，以1次PCR检测结果iss 或iss-来判定iss基因在大肠杆菌中的存在情况。大肠杆菌iss基因通常采用PCR方法或DNA探针方法检测，这2种方法检测结果可能出现不符合性，即某菌株PCR检测可能为iss 而探针检测为iss-，或PCR检测为iss-而探针检测为iss [3-5]。而在实际应用中，多以PCR检测结果判定iss在大肠杆菌中的存在情况。本试验探讨PCR方法检测大肠杆菌iss基因缺陷的原因和改进方法，以提高PCR检测大肠杆菌iss基因的准确性。1材料与方法
1.1菌株及其来源
10株大肠杆菌，分别采自黑龙江省、山东省、贵州省、新疆维吾尔自治区、北京市等地的鸡场。
1.2引物合成
1.3酶类及主要生化试剂
蛋白酶K、RnaseA、rTaq酶、KOD酶、T4DNA连接酶、pMD19-T vector克隆载体及相关试剂，均购自宝泰克生物工程公司；DNA胶回收试剂盒，购自上海华舜生物工程有限公司；所用试验试剂均为分析纯。
1.4大肠杆菌DNA提取
将待测菌琼脂板划线分离，挑取平板上菌落直径2 mm的单菌落；加入40 μL裂解液（10 mmol/L Tris-Cl、pH值为7.5，1 mmol/L EDTA）和50μg/mL蛋白酶K，混匀；55 ℃温育10 min，再于80 ℃温育10 min，加80 μL灭菌三蒸水，-20 ℃保存。
1.5iss基因检测扩增反应体系
iss PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL上游和下游引物各1 μL、大肠杆菌DNA模板5 μL、灭菌三蒸水33.5 μL，rTaq酶0.5 μL，共50 μL。套式PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL 上游和下游引物各1 μL、大肠杆菌DNA模板 2 μL、灭菌三蒸水33.5 μL、rTaq酶0.5 μL，共50 μL。
1.6扩增反应程序
1.6.1rTaq酶PCR扩增反应程序97 ℃预变性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，9个循环；95 ℃ 1 min、48 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重复2次。对PCR扩增反应未得到目的片段的菌株进行套式PCR扩增反应，反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，28个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。经连接转化，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
1.6.2KOD酶PCR扩增反应程序97 ℃预变性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、68 ℃ 30 s，9个循环；95 ℃ 1 min、68 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重复1次。对PCR扩增反应未得到目的片段的菌株进行套式PCR扩增反应，反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s，28个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。同时做空白对照。经连接转化，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
2结果与分析
由表1可见，10株大肠杆菌都含有iss基因；rTaq酶1次PCR检测4株菌株为阳性，6株为阴性，检测率为40%；套式PCR检测出现特异条带，2株菌株检测为阴性，扩增出的iss基因经序列测定，其核苷酸序列符合已发表的iss基因核苷酸序列，rTaq酶套式PCR检出率为80%；KOD酶1次PCR检测7株菌株为阳性，3株为阴性，检出率为70%，但重复性上有差异，阴性、阳性菌株有所不同，套式PCR检测也出现特异条带，10株大肠杆菌都含有iss基因，检出率为100%，扩增出的iss基因经序列测定，其核苷酸序列与已发表的iss基因核苷酸序列也相符。
3结论与讨论
研究发现，iss基因在致病性大肠杆菌中的存在率要高于非致病性大肠杆菌。Johnson等对20株禽大肠杆菌进行iss基因扩增及致病性试验，结果表明，6株致病性菌株为iss基因扩增阳性，14株非致病性菌株中有11株未扩增出iss基因、3株扩增出iss基因[7]。关于iss基因的定位，近来普遍认为iss基因是定位在ColV质粒上。有研究表明，在产生大肠菌素V（colicin V）的菌株中，人血液中有95.5%的菌株携带iss基因，肠道中有68.8%的菌株携带iss基因；禽源大肠杆菌iss基因与ColV同时出现的概率很高，iss基因很可能与ColV质粒连在一起[8-9]。大肠杆菌ColV质粒是低拷贝的大质粒[10-11]。本试验PCR所用模板为菌体经蛋白酶K消化后的粗提物，菌体消化程度可能影响PCR扩增效率，采用常规质粒提取及大质粒提取方法均未获得ColV质粒。另外，由于ColV质粒在各菌株中的拷贝数可能有所差异，也会导致ColV质粒极低拷贝的菌株在1次PCR时未能扩增出目的条带。 试验结果表明，rTaq酶与KOD酶1次PCR时，iss基因的检出率分别为40%、70%，套式PCR检出率分别为80%、100%，KOD酶检测大肠杆菌iss基因的检出率均高于rTaq酶，KOD酶对大肠杆菌iss基因扩增效率优于rTaq酶。在重复性方面，KOD酶1次PCR检测10株菌株中有2株菌株出现差异，可能与模板制备中菌体消化裂解程度及操作误差有关；KOD酶套式PCR结果无差异，采用KOD酶套式PCR检测能降低大肠杆菌iss基因的漏检率。
参考文献：
[1]Tivendale K A，Noormohammadi A H，Allen J L，et al. The conserved portion of the putative virulence region contributes to virulence of avian pathogenic Escherichia coli[J]. Microbiology，2009，155（2）： 450-460.
[2]Ozawa M，Harada K，Kojima A，et al. Antimicrobial susceptibilities，serogroups，and molecular characterization of avian pathogenic Escherichia coli isolates in Japan[J]. Avian Diseases，2008，52（3）： 392-397.
[3]Skyberg J A，Johnson T J，Johnson J R，et al. Acquisition of avian pathogenic Escherichia coli plasmids by a commensal E. coli isolate enhances its abilities to kill chicken embryos，grow in human urine，and colonize the murine kidney[J]. Infection and Immunity，2006，74（11）： 6287-6292.
[4]樊琛，王亚君，李一经. iss基因与鸡大肠杆菌毒力相关性的分析[J]. 畜牧兽医学报，2005，36（1）：58-61.
[5]Johnson T J，Wannemuehler Y，Doetkott C，et al. Identification of minimal predictors of avian pathogenic Escherichia coli virulence for use as a rapid diagnostic tool[J]. Journal of Clinical Microbiology，2008，46（12）： 3987-3996.
[6]樊琛，程霜，刘桂芹，等. 鸡大肠杆菌iss毒力基因研究进展[J]. 江苏农业科学，2014，42（8）：53-54，128.
[7]Johnson T J，Wannemuehler Y M，Nolan L K. Evolution of the iss gene in Escherichia coli[J]. Applied and Environmental Microbiology，2008，74（8）： 2360-2369.
[8]Oguttu J W，Veary C M，Picard J A. Antimicrobial drug resistance of Escherichia coli isolated from poultry abattoir workers at risk and broilers on antimicrobials[J]. Journal of the South African Veterinary Association，2008，79（4）： 161-166.
[9]Chuba P J，Leon M A，Banerjee A，et al. Cloning and DNA sequence of plasmid determinant iss，coding for increased serum survival and surface exclusion，which has homology with lambda DNA[J]. Molecular