【摘 要】
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目的:对免疫相关GTP结合蛋白2(GTPase of immunity-associated protein 2,GIMAP2)进行亚细胞定位分析,为深入研究GIMAP2蛋白的功能奠定基础.方法:使用国家生物技术信息中心(N
【机 构】
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南方医科大学检验与生物技术学院分子免疫研究所,广州510515军事医学研究院生物工程研究所,北京100071;军事医学研究院生物工程研究所,北京,100071;南方医科大学检验与生物技术学院分子免疫研
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目的:对免疫相关GTP结合蛋白2(GTPase of immunity-associated protein 2,GIMAP2)进行亚细胞定位分析,为深入研究GIMAP2蛋白的功能奠定基础.方法:使用国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库查询获取GIMAP2的蛋白序列,再利用生物信息学在线分析工具对GIMAP2蛋白的跨膜结构、核定位信号(nuclear localization signal,NLS)、核输出信号(nuclear export signal,NES)及亚细胞定位进行分析预测.采用PCR技术扩增GIMAP2基因片段,并插入至pQCXIP-mCherry-N1表达载体,用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆.测序正确的重组质粒pQCXIP-GIMAP2-mCherry经过提取、纯化步骤后,与逆转录病毒包装质粒VSVG、Gag/Pol在脂质体介导下共同转入HEK293FT细胞中进行病毒包装.转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-436.使用免疫荧光染色方法检测内、外源性GIMAP2在MDA-MB-436胞内表达定位情况.使用绿色荧光化学染料分别标记稳定表达GIMAP2-mCherry融合蛋白的MDA-MB-436活细胞中的线粒体、内质网、脂滴,在超分辨率显微镜N-SIM下观察其与红色荧光的GIMAP2蛋白的定位情况.结果:生物信息学分析数据显示,由337个氨基酸组成的GIMAP2蛋白在羧基端可能有2个跨膜螺旋结构,其中跨膜螺旋含预期氨基酸数为40 ～41个,紧随跨膜螺旋结构之后的蛋白结构朝细胞质侧;羧基端第279 ～ 281位氨基酸有NES但无NLS;可能定位在内质网.测序结果表明,成功构建表达载体pQCXIP-GIMAP2-mCherry.荧光染色结果证实,GIMAP2-mCherry融合蛋白成功在MDA-MB-436细胞内表达,并与内源性GIMAP2定位一致,分布于内质网和脂滴.结论:免疫相关GTP结合蛋白2定位于内质网和脂滴,可能与脂代谢相关.
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