【摘 要】
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目的构建携带大鼠SOCS3基因的重组腺病毒载体并转染大鼠血管平滑肌细胞,评价其转染效果,为血管增殖性疾病转基因治疗的实验研究奠定基础。方法用BamHⅠ和EcoRⅠ将目的基因pUC
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科,华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学与分子生物学系
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目的构建携带大鼠SOCS3基因的重组腺病毒载体并转染大鼠血管平滑肌细胞,评价其转染效果,为血管增殖性疾病转基因治疗的实验研究奠定基础。方法用BamHⅠ和EcoRⅠ将目的基因pUC57-Simple-rSOCS3及腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-4(带GFP标记)行双酶切。回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化至DH5α感受态。提取质粒酶切鉴定正确后测序。通过LR体外同源重组将rSOCS3表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体上。将腺病毒线性化后转染HEK293细胞包装腺病毒,PCR鉴定此腺病毒中是否含有rSOCS3基因。放大培养并收集病毒,TCD法测定病毒滴度。将此病毒感染大鼠血管平滑肌细胞,荧光显微镜观察感染效率,real-time PCR及免疫印迹检测SOCS3mRNA及蛋白表达。结果 rSOCS3腺病毒穿梭质粒酶切鉴定正确,测序与rSOCS3基因库中的序列完全相符。PCR鉴定pAd/PL-DEST腺病毒表达载体成功携带目的基因rSOCS3。TCD法测定的最终滴度为2×1010pfu/mL。荧光显微镜观察此病毒感染血管平滑肌细胞的效率在80%以上,real-time PCR及免疫印迹检测结果显示血管平滑肌细胞中SOCS3mRNA及蛋白表达明显上调。结论成功构建携带大鼠SOCS3基因的腺病毒载体,并在血管平滑肌细胞中高表达,为血管增殖性疾病转基因治疗的实验研究奠定了基础,具有一定的应用价值。
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