【摘 要】
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目的 构建EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)EBNA1和LMP1融合基因的重组腺病毒,探究重组腺病毒的免疫学作用.方法 以质粒pCXWB-EBNA1和pMV261-LMP1为模板,通过PCR扩增EBNA1和LMP1基因,并通过linker以重叠延伸PCR的方式构建融合基因EBNA1-LMP1,将其与腺病毒穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP通过双酶切、连接构建重组质粒EBNA1-LMP1-pDC316-mCMV-EGFP,并通过PCR、酶切和基因测序进行鉴定.将重组质粒EBNA1
【机 构】
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济宁医学院基础医学院,山东济宁272067;潍坊医学院医学检验学院,山东潍坊261053;济宁医学院基础医学院,山东济宁272067
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目的 构建EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)EBNA1和LMP1融合基因的重组腺病毒,探究重组腺病毒的免疫学作用.方法 以质粒pCXWB-EBNA1和pMV261-LMP1为模板,通过PCR扩增EBNA1和LMP1基因,并通过linker以重叠延伸PCR的方式构建融合基因EBNA1-LMP1,将其与腺病毒穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP通过双酶切、连接构建重组质粒EBNA1-LMP1-pDC316-mCMV-EGFP,并通过PCR、酶切和基因测序进行鉴定.将重组质粒EBNA1-LMP1-pDC316-mCMV-EGFP与包装质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre转染293T细胞以获得重组腺病毒;通过Western blot检测融合基因EBNA1-LMP1在293T细胞中的表达;用重组腺病毒免疫C57BL/6J小鼠,测定小鼠体内CD4+T细胞、CD8+T细胞和细胞因子TNF-α、IFN-γ的比例,观察重组腺病毒的免疫效果.结果 通过PCR获得基因EBNA1 (717 bp)和LMP1(1161 bp),通过重叠延伸PCR获得EBNA1-LMP1(1923 bp)融合基因,经PCR、双酶切以及基因测序证实融合基因EBNA1-LMP1已成功插入腺病毒穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP;Western blot表明融合基因在293T细胞中表达蛋白EBNA1和LMP1,大小约70000.动物实验显示,重组腺病毒免疫组的脾CD4+T细胞、CD8+T细胞占总细胞的54.2％和39.2％;小鼠眼球血中重组腺病毒免疫组CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞占总细胞的54.2％和39.2％;而重组腺病毒免疫组的脾TNF-α和IFN-γ占总细胞因子的0.72％和7.63％,均高于对照组,差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 本实验成功获得了能稳定表达融合蛋白的重组腺病毒,动物实验显示重组腺病毒能有效刺激小鼠体内T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖和细胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌.
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