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研究背景随着我国平均寿命的延长及社会老龄化程度加剧,临床上常见的老年性疾病如膝关节骨性关节炎、髋部骨折、脊柱退行性疾病的患者逐年增加,关节置换术及脊柱内固定术做为骨科医师常规而且切实有效的治疗办法的数量也逐渐增多,为无数患者解除了病痛。尽管如此,感染作为骨科手术严重且可怕的手术并发症,随着手术量增大数量也逐年随之增多。目前临床上把骨科植入物手术后出现感染描述为灾难性的后果,可导致肢体的功能障碍,而且治疗时间较长,再次手术的同时往往需要长时间应用抗生素治疗,严重影响患者的生活质量,治疗相当棘手且花费较大。尤其对于老年患者的脊柱内固定手术和髋膝关节置换手术而言,病人耐受骨科翻修手术的能力差,再手术风险明显加大,部分患者甚至因身体状况差失去手术治疗的机会。由此可见植入物周围感染是关节及脊柱手骨科关节置换手术和脊柱内固定手术并发症中最严重的并发症之一,据统计流行病学初次全髋关节置换手术与全膝关节置换手术的术后感染率在1%到5%之间,关节返修手术感染率更高。因此预防骨科植入物周围感染显得至关重要。骨科植入物周围感染有自身的发病特点,据美国疾控预防中心所做的权威统计,医疗内置物感染在美国住院患者死亡原因中排第五,65%的细菌感染都与生物膜形成有关。对于如何预防细菌在假体周围黏附定植及生物膜的形成,是预防骨科植入物手术感染的关键。目前为止被大家认可的骨科手术感染发病机制主要有两种。第一种是骨科术后细菌通过血性播散定植关节间隙或植入物周围(血型),这是晚期感染比较典型的原因。第二种是手术过程中细菌定植于植入物及假体周围,这种感染往往数天至数月后表现出感染征象。如果在这段时间内细菌不能定居,关节败血症风险迅速降低。如果细菌定植成功则迅速繁殖,聚集,通过高强度水合细胞外基质黏附在假体表面,形成细菌生物膜,产生的代谢物质在生物膜的堆积,生物被膜的微生物其耐药性是那些游离微生物的1000倍,治疗难度明显增加,往往需要取出植入物。从骨科手术后感染发生的过程很明显看出来,抑制术中及术后的细菌定植及细菌生物膜的形成是预防骨科术后感染的关键点。在骨科临床上,国内外目前尚无预防细菌定植及细菌生物膜形成有效的办法。抗生素的预防应用并不能显著减少细菌定植在假体周围。研究表明,在骨科植入物表面形成抗菌涂层对细菌粘附及生物膜形成有良好的抑制作用,为临床预防骨科植入物手术感染提供新的研究方向。银作为抗菌剂早已用于医学领域。纳米技术把银变成纳米大小从而提高了比表面积,增加了与微生物有更好的接触,具有良好的抗菌性能。本课题在骨科常用材料纯钛表面形成纳米银/羟基磷灰石复合无菌涂层并作为细菌粘附载体,对医院获得性金黄色葡萄球菌菌株进行体外培养,研究纳米银/羟基磷灰石复合无菌涂层对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响及其抗菌作用。为以后纳米银/羟基磷灰石复合无菌涂层应用于临床骨科植入物提供实验依据。第一部分纳米银/羟基磷灰石复合涂层的制作及检测目的：在经过打磨抛光处理的纯钛表面制作纳米银/羟基磷灰石复合涂层,并检测制作涂层的物理特征。方法：按质量比为20：1将平均粒径10微米羟基磷灰石原始粉末和平均粒径5微米原始银粉末进行配料,并应用星式球磨机对粉末进行球磨,使混合粉末粒径达到纳米级水平,将得到的纳米级混合粉末放入搅拌机中搅拌混合使其分散均匀。在恒温水浴炉中以钛板作阴极,而不锈钢片做为阳极,纳米银羟基磷灰石混合粉末超声分散于乙醇溶液中,以稀盐酸调节溶液至pH值为4.0,给予电压为20V直流电将混合粉末沉积在钛片上。最后再将样本放置在管式电阻炉中进对行热处理,纳米银/羟基磷灰石复合涂层的钛片样本制作完成。使用红外光谱仪和扫描电子显微镜检测涂层成份和特征。结果：经球磨技术将原始银粉末及羟基磷灰石粉末制作的纳米颗粒粒径平均为100nm左右,经并红外光谱仪和扫描电子显微镜可见纳米银及纳米级羟基磷灰石涂层粉末均匀分散涂层中,涂层在钛基表面固定牢靠。结论：本节对纳米银羟基磷灰石复合涂层的制作流程进行了细致的论述,首先将银粉和羟基磷灰石粉末使用球磨法制备成纳米级复合粉末并充分搅拌混合,然后应用化学共沉淀法在经过处理的钛片制备出了纳米银羟基磷灰石复合涂层。并通过仪器分析出纳米银颗粒相对均匀地分布于羟基磷灰石载体中,纳米银颗粒呈游离状态,纳米颗粒未出现明显聚集,说明通过以上制作工艺及制作流程能够成功的制备出理想的纳米银羟基磷灰石复合抗菌涂层。第二部分体外实验纳米银复合涂层对金黄色葡萄球菌抗菌性能的研究目的：通过在相同条件下不同载体上进行细菌培养,检验纳米银/羟基磷灰石复合涂层对金黄色葡萄球菌的抗菌性能,并与头孢呋辛的抗菌性能进行比较,指标主要是检测生物膜中金黄色葡萄球菌粘附的数量及激光扫描共焦显微镜镜下生物膜形态差异。方法：从临床分离培养提纯的金黄色葡萄球菌作为实验菌株。所有样本经过严格消毒并设四个对比组,纯钛表面羟基磷灰石涂层组,纯钛表面纳米银羟基磷灰石复合涂层组,纯钛表面羟基磷灰石涂层+头孢呋辛组,纯钛表面纳米银羟基磷灰石复合涂层+头孢呋辛组,并相同实验条件下将样本置入菌液培养,每组样本数为12。并于6小时,24小时,48小时,72小时分别检测涂层表面的生物膜,应用激光扫描共聚焦显微镜对生物膜进行形态学观察。分别于24小时、48小时对样本表面的生物膜金黄色葡萄球菌数量进行比较。结果：纯钛表面纳米银羟基磷灰石复合涂层+头孢呋辛组未形成生物膜,纳米银／羟基磷灰石复合涂层组、纯钛表面羟基磷灰石涂层+头孢呋辛组表面48小时后出现生物膜,而羟基磷灰石涂层组在12小时后就出现了成熟的生物膜。纳米银／羟基磷灰石复合涂层组、纯钛表面羟基磷灰石涂层24h和48h在涂层表面粘附菌量有显著差异性p<0.01；同样纯钛表面羟基磷灰石涂层+头孢呋辛组,纯钛表面纳米银羟基磷灰石复合涂层+头孢呋辛组在24小时及48小时生物膜黏附细菌数量比较有明显差异性p<0.01。结论：：纳米银／羟基磷灰石复合涂层可以明显抑制生物膜形成；纳米银与头孢呋辛在抗菌方面具有良好协同作用,纳米银涂层具有良好的抗菌性能。综合相关文献分析在研制新型纳米银材料时,应多方考虑各种影响因素,为确保纳米银产品的安全性,在进入临床应用前必须重复多次进行体外实验和动物实验。据有关工艺学方面的报道称纳米银在常规条件下可被氧化为棕色的氧化银或者发生颗粒聚集而失去纳米所具有的特性,以至于影响该纳米银材料的抗菌效果,需要工艺学方面的研究来解决这个问题。本实验对纳米银涂层抗菌性能的研究,为研制纳米银涂层等相关抗菌制品提供理论基础和实验依据,为下一步进入体内动物实验研究做准备。我们的实验存在的不足为尽管这些研究结果不能尚未进入体内研究阶段,实验选取临床培养所得的金黄色葡萄球菌一种细菌不足以检测纳米银/羟基磷灰石复合涂层的抗菌性能的临床实际意义,其次我们的实验是在体外条件下完成的而不是理想化的环境,因为根据在体内条件下,扩散梯度变化,并且有流体流动,可以显著降低局部纳米银浓度。第三,在细菌计数实验中本试验样本数量不足,更可信的结果有待于通过进一步增加样本数量。第四,纳米银/羟基磷灰石复合涂层对于人工假体的骨长入的影响有待研究。但我们相信,随着条件的成熟和研究的深入,比如动物体内研究及大样本的处理,纳米银在人体内分布吸收及其生物安全性的研究更加完善,纳米银/羟基磷灰石复合涂层产品会大量应用到骨科植入物中。