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摘要： 肌肉骨骼系统包括骨骼、软骨和骨骼肌肉，由于临床修复和再生的迫切需求，其已经成为组织工程研究的主要目标。肌肉骨骼组织工程支架性能主要取决于支架播种的细胞和材料的结构。丝素蛋白组织工程支架的基本功能是将生长因子和种子细胞输送到目标部位，以帮助损伤部位的修复与再生。丝素蛋白存在较好的生物相容性、可调节的生物降解性及优异的机械性而被认为是理想的材料。文章首先介绍了丝素支架在人类健康领域的重要性，其次介绍了支架材料的发展现状，然后论述了不同形式（如薄膜、颗粒、电纺纤维、水凝胶、三维多孔脚手架）制造丝素蛋白仿生支架方面的最新研究，以及它们在肌肉骨骼组织再生方面的应用。最后，展望了丝素蛋白支架的未来发展方向。
关键词：
支架;支架材料;肌肉骨骼组织工程;丝素蛋白;再生医学;生物相容性
中图分类号： R318.08
文献标志码： A
文章编号： 10017003（2021）11001805
引用页码： 111104
DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2021.11.004
Application and research progress of silk fibroin scaffold in musculoskeletal tissue engineering
LI Aiyuan， SHI Xinyu， YUE Wanfu
（College of Animal Science and Technology·College of Veterinary Medicine， Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou 311300， China）
Abstract：
Musculoskeletal system including bone， cartilage and skeletal muscle， has become the primary target of tissue engineering research due to the urgent need for clinical repair and regeneration. The performance of musculoskeletal tissue engineering scaffolds mainly depends on the fabrication and structure of cells and materials seeded on scaffolds. The fundamental function of silk fibroin tissue engineering scaffolds is to transport growth factors and cells to the target sites for facilitating the repair and regeneration of the injuries. Silk fibroin is considered to be an ideal material for its good biocompatibility， adjustable biodegradability and excellent mechanical properties. This paper firstly introduces the importance of silk fibroin in human health and the development status of scaffold materials， and then elaborates the latest research on the manufacturing of silk cellulose biomimetic scaffolds in various forms， such as films， granules， electrospun fibers， hydrogels， and three-dimensional porous scaffolds， as well as their applications in musculoskeletal tissue regeneration. In the end of this paper， the future development direction of silk fibroin scaffolds is prospected.
Key words：
scaffold; scaffold material; musculoskeletal tissue engineering; silk fibroin; regenerative medicine; biocompatibility
基金項目： 浙江省高等学校访问学者教师专业发展项目（2035170004）;浙江省科技厅湖羊肉用发展项目（2045210034）;农业部中蜂高效健康养殖集成及示范推广项目（2060570001）
作者简介： 李艾元（1995），男，硕士研究生，研究方向为动物学。通信作者：岳万福，副教授，yuewanfuzju@aliyun.com。
过度运动和运动不当造成的器官损伤、功能衰竭是威胁人类健康的一个原因[1]，每年有数百万病人死于器官疾病。肌肉骨骼组织包括骨骼、软骨、肌腱、韧带和骨骼肌肉，很容易受伤造成不可逆的影响[2]。然而，这些组织的恢复能力差，通常导致疼痛，关节不稳定，严重时甚至会导致残疾。在临床治疗方法上，通常是用正常组织或器官替换受损部位[3]。人们面临的关键问题是供体短缺，并且这种现象还会长期存在。同时，这种持续的现实性推动了组织工程的发展[4]。 自从利用活细胞制造人造组织的技术出现以来，组织工程领域已经有了很大的发展[5]。在过去的几十年中，组织工程基质发生了从仅作为细胞附着的惰性结构支撑材料到作为组织发育的更复杂的动态环境的巨大变化[6]，未来的研究方向更强调为人工组织发育创造一个仿生微环境[7]。在这样的背景下，以往一直被用作临床缝合线[8]使用的丝素蛋白材料作为天然聚合物，正在成为组织工程有潜力的绿色材料[9]。
1 丝素仿生支架材料在肌肉骨骼组织工程的形态
1.1 多孔仿生支架前处理
由于残留的丝胶蛋白可能导致生物不相容问题，所以肌肉骨骼组织工程中使用的丝素蛋白（Silk Fibroin，SF）应首先彻底去胶化[10]。目前形成了一套工厂化的生产方案：脱胶丝溶解、透析、离心，以获得新鲜的SF溶液[11-12]。SF溶液可以制成薄膜、颗粒、电纺纤维、网、海绵、水凝胶和三维多孔支架，并已广泛应用于肌肉骨骼、血管、皮肤和神经组织工程[13-14]。
表1为脱胶方法及脱胶程度等的汇总。
1.2 薄 膜
SF膜可以从SF溶液中获得，也可以与其他聚合物或生长因子混合[20]。从溶液中获得的SF膜由于大多数仍然是无规卷曲结构，导致SF膜具有水溶性，因此这种浇铸的稳定性成膜率低[21]。为解决这一问题，应采用水退火、拉伸、醇浸等方法对铸膜进行后处理，以提高膜表面的β折叠的结晶度[22]。此外，SF溶液的某些预处理也可以获得水不溶性膜，例如控制干燥过程或向SF溶液中添加甘油[23]。
1.3 颗 粒
SF颗粒可以通过冻结干燥SF溶液或将固体SF磨成微/纳米粒子来产生[24]，还可以通过自组装、冷冻解冻、喷射破碎或喷雾干燥来制造丝素颗粒。虽然磨削颗粒这种物理方法通常用于改善仿生支架机械特性和细胞相容性，但可再生的SF颗粒主要用于药物控释载体。除了大特异性表面和生物相容性外，生物降解性使丝素颗粒在药物输送领域具有很大的优势[25]。纳米粒子在生物医学领域的重要性日益提高，引起了许多研究人员的关注。
1.4 电纺纤维
电纺仪可以将SF变成表面凸起的生物材料[26-27]，粗糙的表面积有利于细胞黏附和增殖。当然制作过程需要适当的黏度溶液，溶剂会挥发，以防止纺纱纤维黏贴。全水过程生产的SF具有良好的生物相容性，然而直接获取的SF溶液很难满足电纺仪对材料的特定要求。纤维的直径大小差异很大，形态不规则，因此，有机溶剂如六氟二醇（HFIP）和福微酸被广泛使用[27]。基于有机溶剂的溶液可以很容易地制成纤维直径相对均匀的电纺丝，但是这种方法同样有缺点，残余的有机溶剂会降低材料与细胞的相容性，同时还会刺激机体的免疫原性。丝素纤维可以制备成各种直径的蛋白纤维材料，主要由溶液获取方式和处理模式（黏度和电导率、场强度、流速、温度、旋转尖端与集合板之间的空间）等环境参数控制。电纺丝素纤维的结构稳定性也可以通过甲醇等有机溶剂处理进一步提高[26，28-29]。
1.5 三维多孔丝素支架
3D生物材料支架的高孔隙率对细胞黏附、生长和迁移至关重要[30]，必需的营养物质和代谢废物都是通过多孔结构交换的。3D多孔支架通常由孔隙浸出、气体发泡或冻干技术制成。冻干式多孔材料的结构参数，如强度和拉伸，可以通过控制冷冻温度和溶液中SF的浓度来调节。通常，较低的冷冻温度会导致毛孔尺寸变小，毛孔尺寸分布在几十到几百微米之间。冷冻干燥的支架具有良好的孔隙和孔结构[31]，而结构稳定性很差，提高β折叠的结晶度可以提高其稳定性。盐浸式3D多孔支架的孔徑取决于孔原颗粒大小，其具有出色的连接结构、高孔隙度和易于调节的孔隙大小[32]。此外，盐浸式3D多孔支架的结构是稳定的。这些优点使盐浸式3D多孔支架在肌肉骨骼组织工程中常用[32]。
1.6 丝素蛋白水凝胶
水凝胶是以水为分散介质的3D聚合物网状结构，其为细胞和生长因子的输送提供了水环境[33]。此外，丝素蛋白水凝胶的物理性能与某些组织再生的承重需求相匹配[1]。SF水凝胶可以使用酒精、酸、声波、离子或嗜酸剂等方法获得，水凝胶中的结构主要是β折叠。SF水凝胶的凝胶过程可受SF溶液的pH值调节[31]，当pH值接近等电点时，凝胶时间将很短。SF凝胶时间还受SF浓度、凝胶温度、离子浓度和超声波功率等因素的影响。上述因素均与SF凝胶的时间负相关[34]。最近有报道表面活性剂可大幅缩短凝胶时间，这对于研发可注射凝胶系统有意义[35]。
1.7 复合支架
天然聚合物和合成聚合物已广泛应用于肌肉骨骼组织工程[2]。聚乳酸（PLA）、聚氨酯（PU）、多丙烯酸等合成材料由于其特性（如降解时间、可塑性和机械特性），可制成有用的生物材料，用于定制某些特定功能组织。然而，上述的这些优势也无法掩盖其降解产物是酸性的缺点，由于对身体有害而限制了它们的发展前景。与合成聚合物相比，虽然胶原蛋白、弹性蛋白、明胶和石棉等天然生物聚合物可以嵌入式结合功能分子获得更好的生物相容性，但材料加工难度高，而且不易得到良好的机械性能[36]。为了克服这些方法的局限性，人们开发了复合支架。组合制造是一种采用两种或两种以上制造技术制造支架的方法，如多孔支架/颗粒、多孔支架/膜、水凝胶/纤维，可以更好地满足组织再生要求，并拓宽SF材料的使用范围[37]。
2 丝素仿生支架在肌肉骨骼组织工程中的应用
2.1 骨组织工程
骨骼是一种结构复杂、高强度、高度血管化的生物结构，由70%的矿物质和30%的干重有机物组成的结缔组织。骨组织包括钙化细胞和骨细胞。骨骼的主要作用是支撑身体，防止体内器官受损，骨损伤或疾病将严重影响生活质量。在这一领域，已经产生各种多孔仿生支架，并研究了这些支架在骨骼再生中使用的影响。然而，能够完全模仿原生骨骼结构的理想仿生支架仍然未能开发出来[38]。 絲素以其优良的生物相容性和良好的机械性能在体外骨骼修复重建中表现良好，可成功将骨骼间充质干细胞分化为成骨细胞。此外有报告称，使用不同溶剂和工艺制作的支架用于骨组织工程时，最佳的孔径在400～600 μm[39]。Uebersax等[40]用全水工艺获得多孔SF支架制作头骨缺陷模型，并测试丝素多孔支架的体内修复能力。活体动物试验结果表明，经过长达8周的植入，检测到了新的骨骼在缺陷处形成。然而，材料单一多孔的SF支架，通常不能满足骨组织工程的机械需求。为了获得具有令人满意机械性能的丝素支架用于骨质组织形成，Rockwood等[41]用SF微粒加固了SF水凝胶。与SF水凝胶相比，弹性模量改进了6倍以上。随着SF支架负荷的增加，丝素支架的机械性能显著提高，同时钙的吸收也大幅增强。
2.2 软骨组织工程
软骨组织使软骨下骨免受关节内的高压影响。软骨没有骨骼那么硬，因此可以有效地分配载荷，以避免大部分损伤。软骨损伤通常与关节不稳定、剧烈疼痛有关[42]。然而，软骨是一种无血管的结缔组织，软骨的自愈能力较差。其中，组织工程植入物仍然是最有潜力的一种绿色修复方法，为软骨再生提供了一种有希望的途径。Wang等[43]通过水性工艺制备了高度多孔的SF支架，并将其与人成纤维细胞（hMSCs）结合用于体外软骨再生。在TGF-β3和地塞米松等诱导剂存在下，hMSCs在3D基质中沿软骨形成途径分化良好[44]。然后，研究人员在相同的SF支架上培养人软骨细胞，发现细胞密度对软骨细胞的分化起决定性作用。这项工作使细胞来源多样化，并与SF基支架结合用于软骨再生应用。在另一项研究中，Mandal等[45]设计了一个三层SF半月板材料系统，以模拟天然半月板结构。将人软骨细胞和成纤维细胞以类似于天然组织的方式种植在支架上，机械性能的改善和细胞外基质ECM的共培养时间结果的一致性表明，该构建物是定向半月板样组织生长的一个有希望的模板。
2.3 骨骼肌组织工程
骨骼肌也叫横纹肌，是指将葡萄糖中储存的化学能有效地转化为机械能的组织，是生物体中最重要的功能器官之一。人体内有600多块骨骼肌，可以引起生物体自身的运动和内脏器官的运动[46]。纵向排列的肌丝以肌动蛋白和肌球蛋白为主要成分构成骨骼肌纤维。创伤性损伤或肌肉萎缩等疾病可能导致肌肉功能损害，尽管已经做了很多尝试，骨骼肌组织再生仍然是一个技术挑战[47]。
SF有利于成肌细胞的增殖和分化。试验证明，SF改性PU支架可用于下咽组织工程。Shen等[48]制备了一种SF的聚合（酯-氨基甲酸乙酯）支架，以改善其亲水性和生物相容性。与对照组相比，骨骼肌细胞和人下咽成纤维细胞增殖分化良好，细胞毒性低，生物相容性好。在大鼠背部皮下植入SF支架后，发现其与周围组织的生物相容性更好，降解速度更快[49]。
3 结 论
通过对国内外丝素支架研究总结，得到以下结论：
1）丝素蛋白能够用作组织工程的原因是因为它良好的细胞相容性、缓慢的生物降解性和优异的机械性能;2）SF支架的特性可以通过调整其二级结构来调节，其中最重要的结构是β折叠;3）丝素蛋白支架能够克服目前手术修复肌肉骨骼的弊端，属于一种绿色的新型生物疗法;4）丝素蛋白支架结合生长因子和其他细胞信号因子来优化细胞功能，支持干细胞生长和增殖;5）基于丝素蛋白的生物材料可以开发为一个可持续的、可生物降解的材料平台，广泛地应用在生物医学方面。
与生长因子结合的生物材料已被证明提高了修复能力，尽管胶原蛋白、弹性蛋白、明胶和壳聚糖等天然生物聚合物由于嵌入功能分子的结构而提供了更好的生物相容性，但具有加工困难和机械性能差等局限性。丝素仿生支架的材料研究已经相当广泛，然而，关于它们的临床应用研究仍然很缺乏。因此，希望加强丝素仿生支架的材料的临床应用研究的同时，进一步深化对丝素蛋白材料应用于各种组织器官组织工程材料的开发研究。
参考文献：
[1]ZAGORSKA M， SOBCZAK M. Hydrogel-based active substance release systems for cosmetology and dermatology application： A review[J]. Pharmaceutics， 2020， 12（5）： 396.
[2]CIMA L G， VACANTI J P， VACANTI C， et al. Tissue engineering by cell transplantation using degradable polymer substrates[J]. Journal of Biomechanical Engineering， 1991， 113（2）： 143-51.
[3]MA D， WANG Y， DAI W. Silk fibroin-based biomaterials for musculoskeletal tissue engineering[J]. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications， 2018， 89： 456-469.
[4]LANGER R， VACANTI J P. Tissue engineering[J]. Science， 1993， 260（5110）： 920-926.
[5]DANG J M， LEONG K W. Natural polymers for gene delivery and tissue engineering[J]. Advanced Drug Delivery Reviews， 2006， 58（4）： 487-99. [6]BHARADWAZ A， JAYASURIYA A C. Recent trends in the application of widely used natural and synthetic polymer nanocomposites in bone tissue regeneration[J]. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications， 2020， 110： 110698.
[7]BAKHSHANDEH B， ZARRINTAJ P， OFTADEH M O， et al. Tissue engineering; strategies， tissues， and biomaterials[J]. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews， 2017， 33（2）： 144-172.
[8]FLOREN M， BONANI W， DHARMARAJAN A， et al. Human mesenchymal stem cells cultured on silk hydrogels with variable stiffness and growth factor differentiate into mature smooth muscle cell phenotype[J]. Acta Biomater， 2016， 31： 156-166.
[9]WANG Y， KIM H J， VUNJAK-NOVAKOVIC G， et al. Stem cellbased tissue engineering with silk biomaterials[J]. Biomaterials， 2006， 27（36）： 6064-6082.
[10]MALAFAYA P B， SILVA G A， REIS R L. Natural-origin polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell delivery in tissue engineering applications[J]. Advanced Drug Delivery Reviews， 2007， 59（4）： 207-233.
[11]WANG Y， RUDYM D D， WALSH A， et al. In vivo degradation of three-dimensional silk fibroin scaffolds[J]. Biomaterials， 2008， 29（24/25）： 3415-3428.
[12]范小红， 徐国平， 刘玉， 等. 棉织带丝素蛋白丝质化后处理工艺[J]. 现代纺织技术， 2020， 28（2）： 76-79.
FAN Xiaohong， XU Guoping， LIU Yu， et al. Treatment process of cotton ribbon with silk fibroin[J]. Advanced Textile Technology， 2020， 28（2）： 76-79.
[13]LI C， VEPARI C， JIN H J， et al. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering[J]. Biomaterials， 2006， 27（16）： 3115-3124.
[14]MOTLAGH D， YANG J， LUI K Y， et al. Hemocompatibility evaluation of poly（glycerol-sebacate） in vitro for vascular tissue engineering[J]. Biomaterials， 2006， 27（24）： 4315-4324.
[15]黄倩， 牛陇星， 梁阿辉， 等. 蚕丝脱胶方法的分析和比较[J]. 现代丝绸科学与技术， 2019， 34（5）： 33-37.
HUANG Qian， NIU Longxing， LIANG Ahui， et al. Analysis and comparison of silk degluing methods[J]. Modern Silk Science and Technology， 2019， 34（5）： 33-37.
[16]林海濤， 封宝山， 陶立全， 等. 蚕丝的苹果酸脱胶[J]. 丝绸， 2013， 50（10）： 1-5.
LIN Haitao， FENG Baoshan， TAO Liquan， et al. Silk’s malic acid degluing[J]. Journal of Silk， 2013， 50（10）： 1-5.
[17]周威. 再生丝素蛋白水溶液的制备条件对其性能的影响[D]. 上海： 东华大学， 2008.
ZHOU Wei. Effect of the Preparation Conditions of the Regenerative Silk Protein Aqueous Solution on Its Performance[D]. Shanghai： Donghua University， 2008.
[18]张雨青. 蚕丝脱胶方法的比较分析[J]. 蚕业科学， 2002（1）： 75-79. ZHANG Yuqing. Comparative analysis of silk degluing methods[J]. Silkworm Science， 2002（1）： 75-79.
[19]趙雯. 酸法和酶法脱胶及柠檬酸脱胶废水预处理[D]. 苏州： 苏州大学， 2012.
ZHAO Wen. Acid and Enzyme Degluing and Citric Acid Degluing Wastewater Pretreatment[D]. Suzhou： Soochou University， 2012.
[20]LU Q， HU X， WANG X， et al. Water-insoluble silk films with silk I structure[J]. Acta Biomater， 2010， 6（4）： 1380-1387.
[21]LV Q， HU K， FENG Q， et al. Preparation of insoluble fibroin/collagen films without methanol treatment and the increase of its flexibility and cytocompatibility[J]. Journal of Applied Polymer Science， 2008， 109（3）： 1577-1584.
[22]KAYABOLEN A， KESKIN D， AYKAN A， et al. Native extracellular matrix/fibroin hydrogels for adipose tissue engineering with enhanced vascularization[J]. Biomed Mater， 2017， 12（3）： 35007.
[23]LASCHKE M W， RUCKER M， JENSEN G， et al. Incorporation of growth factor containing Matrigel promotes vascularization of porous PLGA scaffolds[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A， 2008， 85（2）： 397-407.
[24]YOSHIMIZU H. Preparation and characterization of silk fibroin powder and its application to enzyme immobilization[J]. Journal of Applied Polymer Science， 2010， 40（1）： 127-134.
[25]SEIB F P， JONES G T， RNJAK J， et al. Advanced healthcare materials[J]. Advanced Healthcare Materials， 2013， 2（12）： 1606-1611.
[26]SHAN Y H， PENG L H， LIU X， et al. Silk fibroin/gelatin electrospun nanofibrous dressing functionalized with astragaloside IV induces healing and anti-scar effects on burn wound[J]. International Journal of Pharmaceutics， 2015， 479（2）： 291-301.
[27]ZARKOOB S， EBY R K， RENEKER D H， et al. Structure and morphology of electrospun silk nanofibers[J]. Polymer， 2004， 45（11）： 3973-3977.
[28]NGUYEN T P， NGUYEN Q V， NGUYEN V H， et al. Silk fibroinbased biomaterials for biomedical applications： A review[J]. Polymers， 2019， 11（12）： 1933.
[29]MIN B M， LEE G， KIM S H， et al. Electrospinning of silk fibroin nanofibers and its effect on the adhesion and spreading of normal human keratinocytes and fibroblasts in vitro[J]. Biomaterials， 2004， 25（7/8）： 1289-1297.
[30]FRAUCHIGER D A， TEKARI A， WOLTJE M， et al. A review of the application of reinforced hydrogels and silk as biomaterials for intervertebral disc repair[J]. European Cells & Materials， 2017， 34： 271-290.
[31]MACINTOSH A C， KEARNS V R， CRAWFORD A， et al. Skeletal tissue engineering using silk biomaterials[J]. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine， 2008， 2（2/3）： 71-80. [32]OLIVEIRA A L， SUN L， KIM H J， et al. Aligned silk-based 3-D architectures for contact guidance in tissue engineering[J]. Acta Biomater， 2012， 8（4）： 1530-1542.
[33]MANDAL B B， KAPOOR S， KUNDU S C. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release[J]. Biomaterials， 2009， 30（14）： 2826-2836.
[34]CIOCCI M， CACCIOTTI I， SELIKTAR D， et al. Injectable silk fibroin hydrogels functionalized with microspheres as adult stem cellscarrier systems[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2018， 108： 960-971.
[35]LAOMEEPHOL C， GUEDES M， FERREIRA H， et al. Phospholipid-induced silk fibroin hydrogels and their potential as cell carriers for tissue regeneration[J]. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine， 2020， 14（1）： 160-172.
[36]CHEUNG H， LAU K， LU T， et al. A critical review on polymerbased bio-engineered materials for scaffold development[J]. Composites Part B： Engineering， 2007， 38（3）： 291-300.
[37]LAMMEL A S， HU X， PARK S H， et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery[J]. Biomaterials， 2010， 31（16）： 4583-4591.
[38]KIM H J， KIM U J， KIM H S， et al. Bone tissue engineering with premineralized silk scaffolds[J]. Bone， 2008， 42（6）： 1226-1234.
[39]CORREIA C， BHUMIRATANA S， YAN L P， et al. Development of silk-based scaffolds for tissue engineering of bone from human adipose-derived stem cells[J]. Acta Biomater， 2012， 8（7）： 2483-2492.
[40]UEBERSAX L， APFEL T， NUSS K M， et al. Biocompatibility and osteoconduction of macroporous silk fibroin implants in cortical defects in sheep[J]. European Journal of Pharmaceutics & Biopharmaceutics， 2013， 85（1）： 107-118.
[41]ROCKWOOD D N， GIL E S， PARK S H， et al. Ingrowth of human mesenchymal stem cells into porous silk particle reinforced silk composite scaffolds： An in vitro study[J]. Acta Biomater， 2011， 7（1）： 144-151.
[42]SWIESZKOWSKI W， TUAN B H， KURZYDLOWSKI K J， et al. Repair and regeneration of osteochondral defects in the articular joints[J]. Biomolecular Engineering， 2007， 24（5）： 489-495.
[43]WANG Y， KIM U J， BLASIOLI D J， et al. In vitro cartilage tissue engineering with 3D porous aqueous-derived silk scaffolds and mesenchymal stem cells[J]. Biomaterials， 2005， 26（34）： 7082-7094.
[44]WANG Y， BLASIOLI D J， KIM H J， et al. Cartilage tissue engineering with silk scaffolds and human articular chondrocytes[J]. Biomaterials， 2006， 27（25）： 4434-4442.
关键词：
支架;支架材料;肌肉骨骼组织工程;丝素蛋白;再生医学;生物相容性
中图分类号： R318.08
文献标志码： A
文章编号： 10017003（2021）11001805
引用页码： 111104
DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2021.11.004
Application and research progress of silk fibroin scaffold in musculoskeletal tissue engineering
LI Aiyuan， SHI Xinyu， YUE Wanfu
（College of Animal Science and Technology·College of Veterinary Medicine， Zhejiang Agriculture and Forestry University， Hangzhou 311300， China）
Abstract：
Musculoskeletal system including bone， cartilage and skeletal muscle， has become the primary target of tissue engineering research due to the urgent need for clinical repair and regeneration. The performance of musculoskeletal tissue engineering scaffolds mainly depends on the fabrication and structure of cells and materials seeded on scaffolds. The fundamental function of silk fibroin tissue engineering scaffolds is to transport growth factors and cells to the target sites for facilitating the repair and regeneration of the injuries. Silk fibroin is considered to be an ideal material for its good biocompatibility， adjustable biodegradability and excellent mechanical properties. This paper firstly introduces the importance of silk fibroin in human health and the development status of scaffold materials， and then elaborates the latest research on the manufacturing of silk cellulose biomimetic scaffolds in various forms， such as films， granules， electrospun fibers， hydrogels， and three-dimensional porous scaffolds， as well as their applications in musculoskeletal tissue regeneration. In the end of this paper， the future development direction of silk fibroin scaffolds is prospected.
Key words：
scaffold; scaffold material; musculoskeletal tissue engineering; silk fibroin; regenerative medicine; biocompatibility
基金項目： 浙江省高等学校访问学者教师专业发展项目（2035170004）;浙江省科技厅湖羊肉用发展项目（2045210034）;农业部中蜂高效健康养殖集成及示范推广项目（2060570001）
作者简介： 李艾元（1995），男，硕士研究生，研究方向为动物学。通信作者：岳万福，副教授，yuewanfuzju@aliyun.com。
过度运动和运动不当造成的器官损伤、功能衰竭是威胁人类健康的一个原因[1]，每年有数百万病人死于器官疾病。肌肉骨骼组织包括骨骼、软骨、肌腱、韧带和骨骼肌肉，很容易受伤造成不可逆的影响[2]。然而，这些组织的恢复能力差，通常导致疼痛，关节不稳定，严重时甚至会导致残疾。在临床治疗方法上，通常是用正常组织或器官替换受损部位[3]。人们面临的关键问题是供体短缺，并且这种现象还会长期存在。同时，这种持续的现实性推动了组织工程的发展[4]。 自从利用活细胞制造人造组织的技术出现以来，组织工程领域已经有了很大的发展[5]。在过去的几十年中，组织工程基质发生了从仅作为细胞附着的惰性结构支撑材料到作为组织发育的更复杂的动态环境的巨大变化[6]，未来的研究方向更强调为人工组织发育创造一个仿生微环境[7]。在这样的背景下，以往一直被用作临床缝合线[8]使用的丝素蛋白材料作为天然聚合物，正在成为组织工程有潜力的绿色材料[9]。
1 丝素仿生支架材料在肌肉骨骼组织工程的形态
1.1 多孔仿生支架前处理
由于残留的丝胶蛋白可能导致生物不相容问题，所以肌肉骨骼组织工程中使用的丝素蛋白（Silk Fibroin，SF）应首先彻底去胶化[10]。目前形成了一套工厂化的生产方案：脱胶丝溶解、透析、离心，以获得新鲜的SF溶液[11-12]。SF溶液可以制成薄膜、颗粒、电纺纤维、网、海绵、水凝胶和三维多孔支架，并已广泛应用于肌肉骨骼、血管、皮肤和神经组织工程[13-14]。
表1为脱胶方法及脱胶程度等的汇总。
1.2 薄 膜
SF膜可以从SF溶液中获得，也可以与其他聚合物或生长因子混合[20]。从溶液中获得的SF膜由于大多数仍然是无规卷曲结构，导致SF膜具有水溶性，因此这种浇铸的稳定性成膜率低[21]。为解决这一问题，应采用水退火、拉伸、醇浸等方法对铸膜进行后处理，以提高膜表面的β折叠的结晶度[22]。此外，SF溶液的某些预处理也可以获得水不溶性膜，例如控制干燥过程或向SF溶液中添加甘油[23]。
1.3 颗 粒
SF颗粒可以通过冻结干燥SF溶液或将固体SF磨成微/纳米粒子来产生[24]，还可以通过自组装、冷冻解冻、喷射破碎或喷雾干燥来制造丝素颗粒。虽然磨削颗粒这种物理方法通常用于改善仿生支架机械特性和细胞相容性，但可再生的SF颗粒主要用于药物控释载体。除了大特异性表面和生物相容性外，生物降解性使丝素颗粒在药物输送领域具有很大的优势[25]。纳米粒子在生物医学领域的重要性日益提高，引起了许多研究人员的关注。
1.4 电纺纤维
电纺仪可以将SF变成表面凸起的生物材料[26-27]，粗糙的表面积有利于细胞黏附和增殖。当然制作过程需要适当的黏度溶液，溶剂会挥发，以防止纺纱纤维黏贴。全水过程生产的SF具有良好的生物相容性，然而直接获取的SF溶液很难满足电纺仪对材料的特定要求。纤维的直径大小差异很大，形态不规则，因此，有机溶剂如六氟二醇（HFIP）和福微酸被广泛使用[27]。基于有机溶剂的溶液可以很容易地制成纤维直径相对均匀的电纺丝，但是这种方法同样有缺点，残余的有机溶剂会降低材料与细胞的相容性，同时还会刺激机体的免疫原性。丝素纤维可以制备成各种直径的蛋白纤维材料，主要由溶液获取方式和处理模式（黏度和电导率、场强度、流速、温度、旋转尖端与集合板之间的空间）等环境参数控制。电纺丝素纤维的结构稳定性也可以通过甲醇等有机溶剂处理进一步提高[26，28-29]。
1.5 三维多孔丝素支架
3D生物材料支架的高孔隙率对细胞黏附、生长和迁移至关重要[30]，必需的营养物质和代谢废物都是通过多孔结构交换的。3D多孔支架通常由孔隙浸出、气体发泡或冻干技术制成。冻干式多孔材料的结构参数，如强度和拉伸，可以通过控制冷冻温度和溶液中SF的浓度来调节。通常，较低的冷冻温度会导致毛孔尺寸变小，毛孔尺寸分布在几十到几百微米之间。冷冻干燥的支架具有良好的孔隙和孔结构[31]，而结构稳定性很差，提高β折叠的结晶度可以提高其稳定性。盐浸式3D多孔支架的孔徑取决于孔原颗粒大小，其具有出色的连接结构、高孔隙度和易于调节的孔隙大小[32]。此外，盐浸式3D多孔支架的结构是稳定的。这些优点使盐浸式3D多孔支架在肌肉骨骼组织工程中常用[32]。
1.6 丝素蛋白水凝胶
水凝胶是以水为分散介质的3D聚合物网状结构，其为细胞和生长因子的输送提供了水环境[33]。此外，丝素蛋白水凝胶的物理性能与某些组织再生的承重需求相匹配[1]。SF水凝胶可以使用酒精、酸、声波、离子或嗜酸剂等方法获得，水凝胶中的结构主要是β折叠。SF水凝胶的凝胶过程可受SF溶液的pH值调节[31]，当pH值接近等电点时，凝胶时间将很短。SF凝胶时间还受SF浓度、凝胶温度、离子浓度和超声波功率等因素的影响。上述因素均与SF凝胶的时间负相关[34]。最近有报道表面活性剂可大幅缩短凝胶时间，这对于研发可注射凝胶系统有意义[35]。
1.7 复合支架
天然聚合物和合成聚合物已广泛应用于肌肉骨骼组织工程[2]。聚乳酸（PLA）、聚氨酯（PU）、多丙烯酸等合成材料由于其特性（如降解时间、可塑性和机械特性），可制成有用的生物材料，用于定制某些特定功能组织。然而，上述的这些优势也无法掩盖其降解产物是酸性的缺点，由于对身体有害而限制了它们的发展前景。与合成聚合物相比，虽然胶原蛋白、弹性蛋白、明胶和石棉等天然生物聚合物可以嵌入式结合功能分子获得更好的生物相容性，但材料加工难度高，而且不易得到良好的机械性能[36]。为了克服这些方法的局限性，人们开发了复合支架。组合制造是一种采用两种或两种以上制造技术制造支架的方法，如多孔支架/颗粒、多孔支架/膜、水凝胶/纤维，可以更好地满足组织再生要求，并拓宽SF材料的使用范围[37]。
2 丝素仿生支架在肌肉骨骼组织工程中的应用
2.1 骨组织工程
骨骼是一种结构复杂、高强度、高度血管化的生物结构，由70%的矿物质和30%的干重有机物组成的结缔组织。骨组织包括钙化细胞和骨细胞。骨骼的主要作用是支撑身体，防止体内器官受损，骨损伤或疾病将严重影响生活质量。在这一领域，已经产生各种多孔仿生支架，并研究了这些支架在骨骼再生中使用的影响。然而，能够完全模仿原生骨骼结构的理想仿生支架仍然未能开发出来[38]。 絲素以其优良的生物相容性和良好的机械性能在体外骨骼修复重建中表现良好，可成功将骨骼间充质干细胞分化为成骨细胞。此外有报告称，使用不同溶剂和工艺制作的支架用于骨组织工程时，最佳的孔径在400～600 μm[39]。Uebersax等[40]用全水工艺获得多孔SF支架制作头骨缺陷模型，并测试丝素多孔支架的体内修复能力。活体动物试验结果表明，经过长达8周的植入，检测到了新的骨骼在缺陷处形成。然而，材料单一多孔的SF支架，通常不能满足骨组织工程的机械需求。为了获得具有令人满意机械性能的丝素支架用于骨质组织形成，Rockwood等[41]用SF微粒加固了SF水凝胶。与SF水凝胶相比，弹性模量改进了6倍以上。随着SF支架负荷的增加，丝素支架的机械性能显著提高，同时钙的吸收也大幅增强。
2.2 软骨组织工程
软骨组织使软骨下骨免受关节内的高压影响。软骨没有骨骼那么硬，因此可以有效地分配载荷，以避免大部分损伤。软骨损伤通常与关节不稳定、剧烈疼痛有关[42]。然而，软骨是一种无血管的结缔组织，软骨的自愈能力较差。其中，组织工程植入物仍然是最有潜力的一种绿色修复方法，为软骨再生提供了一种有希望的途径。Wang等[43]通过水性工艺制备了高度多孔的SF支架，并将其与人成纤维细胞（hMSCs）结合用于体外软骨再生。在TGF-β3和地塞米松等诱导剂存在下，hMSCs在3D基质中沿软骨形成途径分化良好[44]。然后，研究人员在相同的SF支架上培养人软骨细胞，发现细胞密度对软骨细胞的分化起决定性作用。这项工作使细胞来源多样化，并与SF基支架结合用于软骨再生应用。在另一项研究中，Mandal等[45]设计了一个三层SF半月板材料系统，以模拟天然半月板结构。将人软骨细胞和成纤维细胞以类似于天然组织的方式种植在支架上，机械性能的改善和细胞外基质ECM的共培养时间结果的一致性表明，该构建物是定向半月板样组织生长的一个有希望的模板。
2.3 骨骼肌组织工程
骨骼肌也叫横纹肌，是指将葡萄糖中储存的化学能有效地转化为机械能的组织，是生物体中最重要的功能器官之一。人体内有600多块骨骼肌，可以引起生物体自身的运动和内脏器官的运动[46]。纵向排列的肌丝以肌动蛋白和肌球蛋白为主要成分构成骨骼肌纤维。创伤性损伤或肌肉萎缩等疾病可能导致肌肉功能损害，尽管已经做了很多尝试，骨骼肌组织再生仍然是一个技术挑战[47]。
SF有利于成肌细胞的增殖和分化。试验证明，SF改性PU支架可用于下咽组织工程。Shen等[48]制备了一种SF的聚合（酯-氨基甲酸乙酯）支架，以改善其亲水性和生物相容性。与对照组相比，骨骼肌细胞和人下咽成纤维细胞增殖分化良好，细胞毒性低，生物相容性好。在大鼠背部皮下植入SF支架后，发现其与周围组织的生物相容性更好，降解速度更快[49]。
3 结 论
通过对国内外丝素支架研究总结，得到以下结论：
1）丝素蛋白能够用作组织工程的原因是因为它良好的细胞相容性、缓慢的生物降解性和优异的机械性能;2）SF支架的特性可以通过调整其二级结构来调节，其中最重要的结构是β折叠;3）丝素蛋白支架能够克服目前手术修复肌肉骨骼的弊端，属于一种绿色的新型生物疗法;4）丝素蛋白支架结合生长因子和其他细胞信号因子来优化细胞功能，支持干细胞生长和增殖;5）基于丝素蛋白的生物材料可以开发为一个可持续的、可生物降解的材料平台，广泛地应用在生物医学方面。
与生长因子结合的生物材料已被证明提高了修复能力，尽管胶原蛋白、弹性蛋白、明胶和壳聚糖等天然生物聚合物由于嵌入功能分子的结构而提供了更好的生物相容性，但具有加工困难和机械性能差等局限性。丝素仿生支架的材料研究已经相当广泛，然而，关于它们的临床应用研究仍然很缺乏。因此，希望加强丝素仿生支架的材料的临床应用研究的同时，进一步深化对丝素蛋白材料应用于各种组织器官组织工程材料的开发研究。
参考文献：
[1]ZAGORSKA M， SOBCZAK M. Hydrogel-based active substance release systems for cosmetology and dermatology application： A review[J]. Pharmaceutics， 2020， 12（5）： 396.
[2]CIMA L G， VACANTI J P， VACANTI C， et al. Tissue engineering by cell transplantation using degradable polymer substrates[J]. Journal of Biomechanical Engineering， 1991， 113（2）： 143-51.
[3]MA D， WANG Y， DAI W. Silk fibroin-based biomaterials for musculoskeletal tissue engineering[J]. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications， 2018， 89： 456-469.
[4]LANGER R， VACANTI J P. Tissue engineering[J]. Science， 1993， 260（5110）： 920-926.
[5]DANG J M， LEONG K W. Natural polymers for gene delivery and tissue engineering[J]. Advanced Drug Delivery Reviews， 2006， 58（4）： 487-99. [6]BHARADWAZ A， JAYASURIYA A C. Recent trends in the application of widely used natural and synthetic polymer nanocomposites in bone tissue regeneration[J]. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications， 2020， 110： 110698.
[7]BAKHSHANDEH B， ZARRINTAJ P， OFTADEH M O， et al. Tissue engineering; strategies， tissues， and biomaterials[J]. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews， 2017， 33（2）： 144-172.
[8]FLOREN M， BONANI W， DHARMARAJAN A， et al. Human mesenchymal stem cells cultured on silk hydrogels with variable stiffness and growth factor differentiate into mature smooth muscle cell phenotype[J]. Acta Biomater， 2016， 31： 156-166.
[9]WANG Y， KIM H J， VUNJAK-NOVAKOVIC G， et al. Stem cellbased tissue engineering with silk biomaterials[J]. Biomaterials， 2006， 27（36）： 6064-6082.
[10]MALAFAYA P B， SILVA G A， REIS R L. Natural-origin polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell delivery in tissue engineering applications[J]. Advanced Drug Delivery Reviews， 2007， 59（4）： 207-233.
[11]WANG Y， RUDYM D D， WALSH A， et al. In vivo degradation of three-dimensional silk fibroin scaffolds[J]. Biomaterials， 2008， 29（24/25）： 3415-3428.
[12]范小红， 徐国平， 刘玉， 等. 棉织带丝素蛋白丝质化后处理工艺[J]. 现代纺织技术， 2020， 28（2）： 76-79.
FAN Xiaohong， XU Guoping， LIU Yu， et al. Treatment process of cotton ribbon with silk fibroin[J]. Advanced Textile Technology， 2020， 28（2）： 76-79.
[13]LI C， VEPARI C， JIN H J， et al. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering[J]. Biomaterials， 2006， 27（16）： 3115-3124.
[14]MOTLAGH D， YANG J， LUI K Y， et al. Hemocompatibility evaluation of poly（glycerol-sebacate） in vitro for vascular tissue engineering[J]. Biomaterials， 2006， 27（24）： 4315-4324.
[15]黄倩， 牛陇星， 梁阿辉， 等. 蚕丝脱胶方法的分析和比较[J]. 现代丝绸科学与技术， 2019， 34（5）： 33-37.
HUANG Qian， NIU Longxing， LIANG Ahui， et al. Analysis and comparison of silk degluing methods[J]. Modern Silk Science and Technology， 2019， 34（5）： 33-37.
[16]林海濤， 封宝山， 陶立全， 等. 蚕丝的苹果酸脱胶[J]. 丝绸， 2013， 50（10）： 1-5.
LIN Haitao， FENG Baoshan， TAO Liquan， et al. Silk’s malic acid degluing[J]. Journal of Silk， 2013， 50（10）： 1-5.
[17]周威. 再生丝素蛋白水溶液的制备条件对其性能的影响[D]. 上海： 东华大学， 2008.
ZHOU Wei. Effect of the Preparation Conditions of the Regenerative Silk Protein Aqueous Solution on Its Performance[D]. Shanghai： Donghua University， 2008.
[18]张雨青. 蚕丝脱胶方法的比较分析[J]. 蚕业科学， 2002（1）： 75-79. ZHANG Yuqing. Comparative analysis of silk degluing methods[J]. Silkworm Science， 2002（1）： 75-79.
[19]趙雯. 酸法和酶法脱胶及柠檬酸脱胶废水预处理[D]. 苏州： 苏州大学， 2012.
ZHAO Wen. Acid and Enzyme Degluing and Citric Acid Degluing Wastewater Pretreatment[D]. Suzhou： Soochou University， 2012.
[20]LU Q， HU X， WANG X， et al. Water-insoluble silk films with silk I structure[J]. Acta Biomater， 2010， 6（4）： 1380-1387.
[21]LV Q， HU K， FENG Q， et al. Preparation of insoluble fibroin/collagen films without methanol treatment and the increase of its flexibility and cytocompatibility[J]. Journal of Applied Polymer Science， 2008， 109（3）： 1577-1584.
[22]KAYABOLEN A， KESKIN D， AYKAN A， et al. Native extracellular matrix/fibroin hydrogels for adipose tissue engineering with enhanced vascularization[J]. Biomed Mater， 2017， 12（3）： 35007.
[23]LASCHKE M W， RUCKER M， JENSEN G， et al. Incorporation of growth factor containing Matrigel promotes vascularization of porous PLGA scaffolds[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A， 2008， 85（2）： 397-407.
[24]YOSHIMIZU H. Preparation and characterization of silk fibroin powder and its application to enzyme immobilization[J]. Journal of Applied Polymer Science， 2010， 40（1）： 127-134.
[25]SEIB F P， JONES G T， RNJAK J， et al. Advanced healthcare materials[J]. Advanced Healthcare Materials， 2013， 2（12）： 1606-1611.
[26]SHAN Y H， PENG L H， LIU X， et al. Silk fibroin/gelatin electrospun nanofibrous dressing functionalized with astragaloside IV induces healing and anti-scar effects on burn wound[J]. International Journal of Pharmaceutics， 2015， 479（2）： 291-301.
[27]ZARKOOB S， EBY R K， RENEKER D H， et al. Structure and morphology of electrospun silk nanofibers[J]. Polymer， 2004， 45（11）： 3973-3977.
[28]NGUYEN T P， NGUYEN Q V， NGUYEN V H， et al. Silk fibroinbased biomaterials for biomedical applications： A review[J]. Polymers， 2019， 11（12）： 1933.
[29]MIN B M， LEE G， KIM S H， et al. Electrospinning of silk fibroin nanofibers and its effect on the adhesion and spreading of normal human keratinocytes and fibroblasts in vitro[J]. Biomaterials， 2004， 25（7/8）： 1289-1297.
[30]FRAUCHIGER D A， TEKARI A， WOLTJE M， et al. A review of the application of reinforced hydrogels and silk as biomaterials for intervertebral disc repair[J]. European Cells & Materials， 2017， 34： 271-290.
[31]MACINTOSH A C， KEARNS V R， CRAWFORD A， et al. Skeletal tissue engineering using silk biomaterials[J]. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine， 2008， 2（2/3）： 71-80. [32]OLIVEIRA A L， SUN L， KIM H J， et al. Aligned silk-based 3-D architectures for contact guidance in tissue engineering[J]. Acta Biomater， 2012， 8（4）： 1530-1542.
[33]MANDAL B B， KAPOOR S， KUNDU S C. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release[J]. Biomaterials， 2009， 30（14）： 2826-2836.
[34]CIOCCI M， CACCIOTTI I， SELIKTAR D， et al. Injectable silk fibroin hydrogels functionalized with microspheres as adult stem cellscarrier systems[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2018， 108： 960-971.
[35]LAOMEEPHOL C， GUEDES M， FERREIRA H， et al. Phospholipid-induced silk fibroin hydrogels and their potential as cell carriers for tissue regeneration[J]. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine， 2020， 14（1）： 160-172.
[36]CHEUNG H， LAU K， LU T， et al. A critical review on polymerbased bio-engineered materials for scaffold development[J]. Composites Part B： Engineering， 2007， 38（3）： 291-300.
[37]LAMMEL A S， HU X， PARK S H， et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery[J]. Biomaterials， 2010， 31（16）： 4583-4591.
[38]KIM H J， KIM U J， KIM H S， et al. Bone tissue engineering with premineralized silk scaffolds[J]. Bone， 2008， 42（6）： 1226-1234.
[39]CORREIA C， BHUMIRATANA S， YAN L P， et al. Development of silk-based scaffolds for tissue engineering of bone from human adipose-derived stem cells[J]. Acta Biomater， 2012， 8（7）： 2483-2492.
[40]UEBERSAX L， APFEL T， NUSS K M， et al. Biocompatibility and osteoconduction of macroporous silk fibroin implants in cortical defects in sheep[J]. European Journal of Pharmaceutics & Biopharmaceutics， 2013， 85（1）： 107-118.
[41]ROCKWOOD D N， GIL E S， PARK S H， et al. Ingrowth of human mesenchymal stem cells into porous silk particle reinforced silk composite scaffolds： An in vitro study[J]. Acta Biomater， 2011， 7（1）： 144-151.
[42]SWIESZKOWSKI W， TUAN B H， KURZYDLOWSKI K J， et al. Repair and regeneration of osteochondral defects in the articular joints[J]. Biomolecular Engineering， 2007， 24（5）： 489-495.
[43]WANG Y， KIM U J， BLASIOLI D J， et al. In vitro cartilage tissue engineering with 3D porous aqueous-derived silk scaffolds and mesenchymal stem cells[J]. Biomaterials， 2005， 26（34）： 7082-7094.
[44]WANG Y， BLASIOLI D J， KIM H J， et al. Cartilage tissue engineering with silk scaffolds and human articular chondrocytes[J]. Biomaterials， 2006， 27（25）： 4434-4442.