微小RNA在HBx缺失突变体致肝细胞增殖中的作用及其机制

• 作 者: 符小玉 谭德明 侯周华 胡志亮 刘国珍 欧阳奕 刘菲
• 机 构: 410008长沙,中南大学湘雅医院感染科,410008长沙,中南大学湘雅医院感染科,410008长沙,中南大学湘雅医院感染科,南京市传染病医院,410008长沙,中南大学湘雅医院感染科,410008长
• 出 处: 中华肝脏病杂志
• 发表日期: 2012年20期
• 关键词: Carcinoma hepatocellular RNA Hepatitis B virus Mutation Cell proliferation

目的 研究微小RNA (miRNA)在HBx缺失突变体致人肝细胞异常增殖中的作用及其相关机制. 方法 利用miRNA芯片技术检测稳定表达HBx-d382及HBx的L02(即分别含HBx基因缺失突变体HBx-d382及野生型HBx基因)细胞系中miRNA的表达,实时荧光定量PCR对上述miRNA进行验证.选取在L02/HBx-d382和L02/HBx细胞中均表达明显下调的两个miRNA:miR-338-3P、miR-551b进行功能研究,分为实验组(转染miRNA模拟物组)、阴性对照组(NC,转染miRNA阴性对照)及脂质体组(lipo,单加转染试剂),通过脂质体转染到细胞中,四甲基偶氮唑盐法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期,实时荧光定量PCR和Wstern blot检测细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白G1和E2F转录因子的改变.采用SPSS 16.0统计软件,数据均进行了正态检验并符合正态性,组间均数比较采用成组t检验. 结果 (1)与L02/pcDNA3.0细胞比较,L02/HBx-d382细胞有6个miRNA表达上调,5个miRNA表达下调; L02/HBx细胞有4个miRNA表达上调,12个miRNA表达下调.实时荧光定量PCR验证的结果与芯片相一致.(2)转染了miR-338-31p-模拟物和miR-551b-模拟物后,L02/HBx-d382及L02/HBx细胞增殖均受抑制,细胞周期均阻滞在G1期,细胞增殖能力减弱.L02/HBx-d382细胞中,细胞增殖能力:lipo组、NC组、miR-338-3p组和miR-551b组分别为90.0％±1.3％、88.0％±1.6％、56.0％±6.1％和62.0％±6.4％,miR-338-3p组与:lipo组、NC组比较,t值分别为10.402、9.133 ;miR-551b组和与lipo组、NC组比较,t值分别为8.763、7.403,P值均＜0.01.L02/HBx细胞中,细胞增殖能力:lipo组、NC组、miR-338-3p组和miR-551b组分别为91.0％±1.7％、89.0％±2.1％、60.0％±7.7％和66.0％±9.3％,miR-338-3p组与lipo组、NC组比较,t值分别为9.105、8.074;miR-551b组与lipo组、NC组比较,t值分别为7.673、7.52,P值均＜0.01.实时荧光定量PCR检测结果显示细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白G1和E2F转录因子的mRNA水平均无明显改变,但Western blot法发现上述基因的蛋白表达均明显下调,差异有统计学意义. 结论 ①HBx及其缺失突变体能影响L02细胞的miRNA表达谱;②在L02/HBx-d382细胞中下调更明显的miR-338-3p和miR-551b可能通过调控细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白G1和E2F转录因子的表达而调节了细胞的生长。