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摘 要：在过去的20多年中，经过科学者们的不断的改良、摸索以及与其他方法相结合，如今聚合酶链式反应（PCR）技术已发展为有数十种之多的研究方法和研究手段。
关键词：PCR；农业技术；发展简史；基本原理
中图分类号： Q555 文献标识码：A
在生物学领域中，聚合酶链式反应作为体外扩增基因序列的生物技术占有很重要的位置，并且与分子克隆技术和DNA序列分析方法构成了分子生物学实验工作和学习的基础。PCR技术的发明成为了生物界的里程碑并且是分子生物学的一项伟大的革命，它随之带来的是分子生物学以及生物技术在工业和产业的推进和发展[1]。
1 PCR技术发展简史
1971年Khorana最早提出了一个大胆的设想，那就是核酸体外扩增。但是，当时对于基因的排序和测序分析方法并不成熟，还没有发现对热定性的DNA聚合酶，所以这个想法没有任何实际意义的[2]。1985年美国的Kary Mullis受到高速公路的启发，在科学Science杂志上发表了PCR技术学术论文。20世纪80年代初，美国科学家Keohanog通过对实验室中所使用的酶的改进，大大提高了扩增的可实行性[3-5]。在之后的几十年里，PCR技术已经发展为十几种研究领域。
2常用的PCR技术
2.1 原位PCR
原位PCR是在组织切片或组织细胞里进行的PCR反应，它具有高度特异敏感和细胞定位能力，可以在细胞和分子水平上检测转特定的基因序列 [2]。
2.2 不对称PCR
不对称PCR是在PCR反应过程中采用两种不同浓度的寡核苷酸引物，经过若干轮采用循环后，待低浓度的引物被消耗尽，随后的循环只产生高浓度的产物既延伸产物，结果产生了大量的特异单链DNA[2]。
2.3 逆转录—PCR
逆转录PCR是以反转录DNA即cDNA作为模板进行PCR反应，能够使mRNA呈现多态性并且利用基因表达测定的强度和鉴定已被转录的序列是否发生突变，主要克隆mRNA的3’和5’的末端序列，以及可以从非常少量的信使RNA样品中构建cDNA文库[5]。可以使分析一些极为微量的RNA样品变为可能[6-8]。
2.4 反向PCR
PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。
2.5 多重PCR
多重PCR在同一个PCR反应系统中加入了两对或两对以上的寡核苷酸引物，并且同时能扩增出数量较多的核酸片段的PCR，其反应原理和操作过程一般与其他PCR相同[4-7]。
2.6巢式PCR
巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用兩对PCR引物扩增完整的片段。第1对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第2对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部，使得第2次PCR扩增片段短于第1次扩增 。
2.7锚定PCR
用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增[8]。
2.8重组PCR
重组PCR就是使两个不相邻的基因片段重组在一起的PCR。但是重组PCR所重组的基因片段长度都在1kb左右，因此在长片段的重组技术和提高准确度来说目前还有比较大的难度。
2.9定量PCR技术
PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。目前，主要采用定量的PCR方法主要包括设立内参照物的定量PCR、极限稀释法、荧光定量PCR、FQ-PCR、定时定量PCR等。
2.10 热不对称性PCR
热不对称性PCR是以基因组的DNA作为模板，并且利用依照目标的序列已知序列设计出3个具有较高退火温度的嵌套特异性引物，和一个长度较为短Tm值的随机简并引物进行组合，通过3轮具有热不对称的温度循环进行分级和扩增PCR，并且在获得已知序列的侧翼序列后用3个嵌套特异性引物分别与简并引物组合来进行PCR反应。
3 结论
PCR技术是一种极为重要的分子生物学研究的基础技术，还可以成为基因工程来提供目的基因，并且广泛地应用在亲自鉴定、个体识别、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR技术已经渗透到生物科学的各个领域。
参考文献
[1] 章静波，黄东阳，方瑾，等.细胞生物学实验技术[M].化学工业出版社，2006：173-178.
[2] 吴文麟，黄东益，庄南生. 原位PCR及其在植物研究中的应用[J].热带农业科学，2006，26（2）：65-69.
[3] 章维锗，邢军，刘军，等.现代分子生物学实验手册[M].科学出版社，2003：269-275.
[4] 邓文星，张映.实时荧光定量PCR技术综述[J].生物技术通报，2007（5）：93-103.
[5] 赵红庆，宛锡铜，黄留玉.多重PCR技术在病原检测中的应用[J].生物技术通讯，2008，18（9）：863-865.
[6] 黄留玉.PCR最新技术原理、方法及应用[M].化学工业出版社，2005：245-247.
[7] 黄留玉，史兆兴，苏国富，等.PCR最新技术原理、方法及应用[M].化学工业出版社，2004： 258-260.
[8] 陈柏君，孙超，王勇，等.锚定PCR（Anchored PCR）：一种新的染色体步行方法[J].科学通报，2004，49（15）：1569-1571.
作者简介：刘黎红（1971.3-），女，汉族，吉林长春人，副教授。任职于长春职业技术学院食品与生物技术分院，研究方向：生物技术。
关键词：PCR；农业技术；发展简史；基本原理
中图分类号： Q555 文献标识码：A
在生物学领域中，聚合酶链式反应作为体外扩增基因序列的生物技术占有很重要的位置，并且与分子克隆技术和DNA序列分析方法构成了分子生物学实验工作和学习的基础。PCR技术的发明成为了生物界的里程碑并且是分子生物学的一项伟大的革命，它随之带来的是分子生物学以及生物技术在工业和产业的推进和发展[1]。
1 PCR技术发展简史
1971年Khorana最早提出了一个大胆的设想，那就是核酸体外扩增。但是，当时对于基因的排序和测序分析方法并不成熟，还没有发现对热定性的DNA聚合酶，所以这个想法没有任何实际意义的[2]。1985年美国的Kary Mullis受到高速公路的启发，在科学Science杂志上发表了PCR技术学术论文。20世纪80年代初，美国科学家Keohanog通过对实验室中所使用的酶的改进，大大提高了扩增的可实行性[3-5]。在之后的几十年里，PCR技术已经发展为十几种研究领域。
2常用的PCR技术
2.1 原位PCR
原位PCR是在组织切片或组织细胞里进行的PCR反应，它具有高度特异敏感和细胞定位能力，可以在细胞和分子水平上检测转特定的基因序列 [2]。
2.2 不对称PCR
不对称PCR是在PCR反应过程中采用两种不同浓度的寡核苷酸引物，经过若干轮采用循环后，待低浓度的引物被消耗尽，随后的循环只产生高浓度的产物既延伸产物，结果产生了大量的特异单链DNA[2]。
2.3 逆转录—PCR
逆转录PCR是以反转录DNA即cDNA作为模板进行PCR反应，能够使mRNA呈现多态性并且利用基因表达测定的强度和鉴定已被转录的序列是否发生突变，主要克隆mRNA的3’和5’的末端序列，以及可以从非常少量的信使RNA样品中构建cDNA文库[5]。可以使分析一些极为微量的RNA样品变为可能[6-8]。
2.4 反向PCR
PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。
2.5 多重PCR
多重PCR在同一个PCR反应系统中加入了两对或两对以上的寡核苷酸引物，并且同时能扩增出数量较多的核酸片段的PCR，其反应原理和操作过程一般与其他PCR相同[4-7]。
2.6巢式PCR
巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用兩对PCR引物扩增完整的片段。第1对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第2对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部，使得第2次PCR扩增片段短于第1次扩增 。
2.7锚定PCR
用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增[8]。
2.8重组PCR
重组PCR就是使两个不相邻的基因片段重组在一起的PCR。但是重组PCR所重组的基因片段长度都在1kb左右，因此在长片段的重组技术和提高准确度来说目前还有比较大的难度。
2.9定量PCR技术
PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。目前，主要采用定量的PCR方法主要包括设立内参照物的定量PCR、极限稀释法、荧光定量PCR、FQ-PCR、定时定量PCR等。
2.10 热不对称性PCR
热不对称性PCR是以基因组的DNA作为模板，并且利用依照目标的序列已知序列设计出3个具有较高退火温度的嵌套特异性引物，和一个长度较为短Tm值的随机简并引物进行组合，通过3轮具有热不对称的温度循环进行分级和扩增PCR，并且在获得已知序列的侧翼序列后用3个嵌套特异性引物分别与简并引物组合来进行PCR反应。
3 结论
PCR技术是一种极为重要的分子生物学研究的基础技术，还可以成为基因工程来提供目的基因，并且广泛地应用在亲自鉴定、个体识别、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR技术已经渗透到生物科学的各个领域。
参考文献
[1] 章静波，黄东阳，方瑾，等.细胞生物学实验技术[M].化学工业出版社，2006：173-178.
[2] 吴文麟，黄东益，庄南生. 原位PCR及其在植物研究中的应用[J].热带农业科学，2006，26（2）：65-69.
[3] 章维锗，邢军，刘军，等.现代分子生物学实验手册[M].科学出版社，2003：269-275.
[4] 邓文星，张映.实时荧光定量PCR技术综述[J].生物技术通报，2007（5）：93-103.
[5] 赵红庆，宛锡铜，黄留玉.多重PCR技术在病原检测中的应用[J].生物技术通讯，2008，18（9）：863-865.
[6] 黄留玉.PCR最新技术原理、方法及应用[M].化学工业出版社，2005：245-247.
[7] 黄留玉，史兆兴，苏国富，等.PCR最新技术原理、方法及应用[M].化学工业出版社，2004： 258-260.
[8] 陈柏君，孙超，王勇，等.锚定PCR（Anchored PCR）：一种新的染色体步行方法[J].科学通报，2004，49（15）：1569-1571.
作者简介：刘黎红（1971.3-），女，汉族，吉林长春人，副教授。任职于长春职业技术学院食品与生物技术分院，研究方向：生物技术。