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摘要[目的]克隆杜梨硝酸盐高亲和性转运酶NRT2基因。[方法]以杜梨叶片为试验材料，采用CTAB法提取总RNA，反转录成cDNA，运用3′-RACE和5′-RACE技术，克隆获得杜梨硝酸盐转运酶NRT2基因的全长，并运用生物信息学技术对硝酸盐转运酶NRT2基因进行了分析。[结果]杜梨硝酸盐转运NRT2基因cDNA全长为1 422 bp，可编码473个氨基酸，分子式为C2346H3631N589O637S26，相对分子质量为51 112.7，等电点（pI）为7.03。[结论]该试验为进一步研究梨氮素代谢提供了基础资料。
关键词 杜梨；硝酸盐转运酶基因；克隆
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）02-0161-03
Abstract[Objective] To clone the highaffinity nitrate transporter gene NRT2 of Pyrus betulaefolia Bunge.[Method] The leaves of P.betulaefolia Bunge were used as materials，total RNA was extracted by CTAB method，then the RNA was reversetranscribed into the cDNA，and the full nitrate transporter gene NRT2 was cloned by 3′RACE and 5′RACE technique.The NRT2 gene were analyzed by bioinformatics techniques.[Result] The cDNA fulllength of the nitrate transporter NRT2 gene was 1 422 bp，encoding 473 amino acids，molecular formula was C2346H3631N589O637S26，molecular weight was 51 112.7，and isoelectric point （pI） was 7.03.[Conclusion] This study provides basic data for further research on nitrogen metabolism in pear.
Key words Pyus betulaefolia Bunge；Nitrate transfer enzyme gene；Cloning
氮是植物生长的三大营养元素之一，广泛地参与植物生长、发育的全部过程[1]。植物从土壤中吸收的氮素主要来自土壤中的硝酸盐类化合物，而吸收氮素的主要部位是植物根表皮细胞[2]。植物根表皮细胞上有NO3-高亲和转运系统和低亲和系统，高亲和转运系统在NO3-浓度为0.2～0.5 mmol/L时发挥作用，而在NO3-浓度高于0.5 mmol/L时主要是低亲和转运系统发挥作用[3-5]。2条转运途径能够保证植物较好地利用土壤中的硝酸盐类化合物，从而减少因为土壤硝酸盐浓度过大或过小对植物造成伤害。
我国是梨的第一大生产国，2012年栽培面积达108.9 hm2，占世界梨树栽培面积的70.0%，产量1 707.3万t，达世界总产的69.0%[6]。在我国梨主产区，如西北地区、黄河古道地区等，多为碱性土壤，多数品种都是用杜梨（Pyus betulaefolia Bunge）作为砧木，因此研究杜梨硝酸盐高亲和性转运酶有重要意义。氮素在梨树器官中转移的主要存在形式是硝酸根和铵根，其中硝酸盐转运酶基因在植物体内硝酸根的转移与吸收中起重要作用。目前，国内外关于杜梨硝酸盐转运酶NRT2基因研究还未见报道，该試验拟克隆硝酸盐转运酶基因，以期为今后开展梨树氮素吸收与利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 杜梨组培苗的幼嫩叶片，加液氮处理，研磨成粉末，保存在-80℃冰箱中备用。
1.2 仪器 DYY-6型水平双稳电泳仪、凝胶成像系统、DU800分光光度计、WH-1微型漩涡混合仪、LX-200迷你离心机、Biometra PCR扩增仪、冷冻高速离心机、化水机等。
1.3 方法
1.3.1 总RNA的提取。采用改良CTAB法提取总RNA[7]。
1.3.2 RNA反转录。将提取的总RNA用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录成cDNA。
1.3.3 NRT2基因克隆。从基因库中查找到梨的硝酸盐转运酶基因相关序列，并在其保守区域使用软件Primer Premier 5.0进行引物设计（表1）。
3′-RACE和5′-RACE按试剂盒操作步骤进行，经测序、剪接、拼接后获得NRT2基因的cDNA全长序列。
1.3.4 生物信息学分析。蛋白质理化性质在线分析，http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html；蛋白质结构域分析，http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/；疏水性分析，http：//www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl，参数选择，Hphob./ Kyte & Doolittle；磷酸化位点分析，http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/；亚细胞定位分析，http：//psort.hgc.jp/form.html；氨基酸二级结构预测运用PBIL LYON-GERLAND数据库进行在线分析，http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_hnn.html。 2 结果与分析
2.1 总RNA的提取及cDNA检测 从图1可以看出，提取的总RNA有很明显的2个条带，分别是28S和18S，从亮度上可以判断28S带比18S带亮2倍左右，且2个条带后面都没有拖带现象，说明RNA没被降解，完整性较好。
2.2 NRT2基因的克隆
以杜梨cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，结果如图2所示，获得了1条400 bp左右的条带，经测序，NRT2基因片段大小为403 bp，与苹果的MdNRT2.7（Accession：XM_008359511）相似性达90.58%。
用NRT2PR1 out primer与3′-RACE Outer Prime进行第1轮扩增，以其PCR产物为模板，用NRT2PR1 inner primer和3′-RACE Inner Primer为引物进行第2轮扩增，扩增产物经测序，得到大小为744 bp NRT2的3′-RACE序列（图3）。
用5′-NRT2O与UPM Long进行第1轮扩增，以其PCR产物为模板，用5′-NRT2I与UPM Short作为引物进行第2轮扩增，扩增产物经测序，得到大小为313 bp NRT2的5′-RACE序列（图4）。
2.3 杜梨硝酸盐转运酶NRT2基因生物信息学分析
将NRT2基因扩增片段序列、3′-RACE和5′-RACE序列拼接，基因全长1 460 bp，其中编码序列长为1 422 bp，编码473个氨基酸序列。在GenBank上进行Nucleotide Blast比对，与MdNRT2.7硝酸盐转运基因相似性最高，达99%。
將试验得到的NRT2氨基酸序列与基因库中其他植物的转运硝酸盐蛋白进行多重氨基酸序列对比，结果表明杜梨NRT2蛋白与苹果MdNRT2.7蛋白相似度最高（图5），达94.28%。系统进化树显示，杜梨NRT2蛋白首先与苹果MdNRT2.7蛋白聚为一类（图6），因此，克隆的NRT2基因就是杜梨硝酸盐转运基因，将其命名为PbeNRT2。
蛋白质理化性质在线分析结果表明，分子式为C2 346H3 631N589O637S26，相对分子质量为51 112.7，等电点（pI）为7.03。
蛋白质结构域分析结果表明，亮氨酸Leu（12.9%）是含量最高的氨基酸，其次为甘氨酸Gly（9.5%）、丙氨酸Ala（9.3%），最低的是组氨酸His（1.5%）。
蛋白质疏水性分析结果表明，亲水性最强的氨基酸是分值为-2.589的第239位谷氨酸Glu，疏水性最强的氨基酸是分值为3.011的第345位亮氨酸Leu。蛋白质磷酸化位点分析结果表明，蛋白激酶的磷酸化位点可能是1个丝氨酸Ser、1个苏氨酸Thr和2个酪氨酸Tyr。亚细胞定位分析结果表明，该蛋白定位于叶绿体基质的概率为60.0%，定位于叶绿体类囊体膜的概率为45.8%，定位于高尔基体的概率为40.0%，定位于内质网的概率为36.0%，推测该蛋白定位于叶绿体的概率最大。蛋白预测的二级结构由α-螺旋（54.12%）、无规则卷曲（36.58%）和延伸链（9.30%）组成。
3 讨论
根据转运系统的不同可以将植物NO3-转运蛋白基因分为低亲和NO3-转运家族（NRT1）和高亲和NO3-转运家族（NRT2和NAR2）[8-10]。拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AtNRT1家族共有53个成员[11]，参与NO3-转运蛋白基因主要是AtNRT1.1、AtNRT1.2[12-13]。NRT1.1编码1个受硝酸盐诱导的双重亲和的转运蛋白，在低氮和高氮条件下均能较好地吸收NO3-[14]。而NRT1.2编码的是典型的低亲和转运蛋白，主要在根系表皮细胞中表达，在高NO3-浓度下起作用[15]。NRT2在拟南芥有7个家族基因，其中起主要作用的转运蛋白基因是AtNRT2.1和AtNRT2.2[16]。NRT2.1和NRT2.2是植物重要的NO3-转运蛋白基因，在低氮条件下，调控植物根系吸收NO3-[17]。该研究克隆的杜梨PbeNRT2为高亲和性硝酸盐转运酶基因，对于低浓度的NO3-起作用，为今后开展梨树根系氮素的高效利用和分子机理研究提供了基础资料。
参考文献
[1] 鲜开梅.不同氮素水平处理对彩椒植株生长及产量的影响[J].北方园艺，2015（2）：26-29.
[2] CRAWFORD N M，GLASS A D M.Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants[J].Trends in plant science，1998，3（10）：389-395.
[3] MARSCHNER H，RMHELD V，KISSEL M.Different strategies in higher plants in mobilization and uptake of iron[J].Journal of plant nutrition，1986，9（3/4/5/6/7）：695-713.
[4] 肖焱波，李文学，段宗颜，等.植物对硝态氮的吸收及其调控[J].中国农业科技导报，2002，4（2）：56-59.
[5] MORGAN M A，JACKSON W A，VOLK R J.Concenrtationdependence of the nitrate assimilation pathway in maize roots[J].Plant science，1985，38（3）：185-191.
[6] 李秀根.改革开放30年我国梨产业的发展回顾[J].烟台果树，2008，104（4）：4-6. [7] 王西成，喬玉山，欧春青，等.三种梨果皮总RNA提取方法的比较研究[J].甘肃农业大学学报，2010，45（2）：91-94.
[8] FORDE B G.The role of longdistance signalling in plant responses to nitrate and other nutrients[J].Journal of experimental botany，2002，53（366）：39-43.
[9] GANSEL X，MUN～ OS S，TILLARD P，et al.Differential regulation of the NO3- and NH4+ transporter genes AtNrt2.1 and AtAmt1.1 in Arabidopsis：Relation with longdistance and local controls by N status of the plant[J].The plant journal，2001，26（2）：143-155.
[10] GALVN A，FERNNDEZ E.Eukaryotic nitrate and nitrite transporters[J].Cellular and molecular life sciences，2001，58（2）：225-233.
[11] PLETT D，TOUBIA J，GARNETT T，et al.Dichotomy in the NRT gene families of dicots and grass species[J].Plos one，2010，5（12）：15289.
[12] TSAY Y F，SCHROEDER J I，FELDMANN K A，et al.The herbicide sensitivity gene CHL1 of Arabidopsis encodes a nitrateinducible nitrate transporter[J].Cell，1993，72（5）：705-713.
[13] OKAMOTO M，VIDMAR J J，GLASS A D.Regulation of NRT1 and NRT2 gene families of Arabidopsis thaliana：Responses to nitrate provision[J].Plant and cell physiology，2003，44（3）：304-317.
[14] LIU K H，HUANG C Y，TSAY Y F.CHL1 is a dualaffinity nitrate transporter of Arabidopsis involved in multiple phases of nitrate uptake[J].The plant cell，1999，11（5）：865-874.
[15] HUANG N C，LIU K H，LO H J，et al.Cloning and functional characterization of an Arabidopsis nitrate transporter gene that encodes a constitutive component of lowaffinity uptake[J].The plant cell，1999，11（8）：1381-1392.
[16] NAZOA P，VIDMAR J J，TRANBARGER T J，et al.Regulation of the nitrate transporter gene AtNRT2.1 in Arabidopsis thaliana：Responses to nitrate，amino acids and developmental stage[J].Plant molecular biology，2003，52（3）：689-703.
[17] CEREZO M，TILLARD P，FILLEUR S，et al.Major alterations of the regulation of root NO3- uptake are associated with the mutation of Nrt2.1 and Nrt2.2 genes in Arabidopsis[J].Plant physiology，2001，127（1）：262-271.
关键词 杜梨；硝酸盐转运酶基因；克隆
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）02-0161-03
Abstract[Objective] To clone the highaffinity nitrate transporter gene NRT2 of Pyrus betulaefolia Bunge.[Method] The leaves of P.betulaefolia Bunge were used as materials，total RNA was extracted by CTAB method，then the RNA was reversetranscribed into the cDNA，and the full nitrate transporter gene NRT2 was cloned by 3′RACE and 5′RACE technique.The NRT2 gene were analyzed by bioinformatics techniques.[Result] The cDNA fulllength of the nitrate transporter NRT2 gene was 1 422 bp，encoding 473 amino acids，molecular formula was C2346H3631N589O637S26，molecular weight was 51 112.7，and isoelectric point （pI） was 7.03.[Conclusion] This study provides basic data for further research on nitrogen metabolism in pear.
Key words Pyus betulaefolia Bunge；Nitrate transfer enzyme gene；Cloning
氮是植物生长的三大营养元素之一，广泛地参与植物生长、发育的全部过程[1]。植物从土壤中吸收的氮素主要来自土壤中的硝酸盐类化合物，而吸收氮素的主要部位是植物根表皮细胞[2]。植物根表皮细胞上有NO3-高亲和转运系统和低亲和系统，高亲和转运系统在NO3-浓度为0.2～0.5 mmol/L时发挥作用，而在NO3-浓度高于0.5 mmol/L时主要是低亲和转运系统发挥作用[3-5]。2条转运途径能够保证植物较好地利用土壤中的硝酸盐类化合物，从而减少因为土壤硝酸盐浓度过大或过小对植物造成伤害。
我国是梨的第一大生产国，2012年栽培面积达108.9 hm2，占世界梨树栽培面积的70.0%，产量1 707.3万t，达世界总产的69.0%[6]。在我国梨主产区，如西北地区、黄河古道地区等，多为碱性土壤，多数品种都是用杜梨（Pyus betulaefolia Bunge）作为砧木，因此研究杜梨硝酸盐高亲和性转运酶有重要意义。氮素在梨树器官中转移的主要存在形式是硝酸根和铵根，其中硝酸盐转运酶基因在植物体内硝酸根的转移与吸收中起重要作用。目前，国内外关于杜梨硝酸盐转运酶NRT2基因研究还未见报道，该試验拟克隆硝酸盐转运酶基因，以期为今后开展梨树氮素吸收与利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 杜梨组培苗的幼嫩叶片，加液氮处理，研磨成粉末，保存在-80℃冰箱中备用。
1.2 仪器 DYY-6型水平双稳电泳仪、凝胶成像系统、DU800分光光度计、WH-1微型漩涡混合仪、LX-200迷你离心机、Biometra PCR扩增仪、冷冻高速离心机、化水机等。
1.3 方法
1.3.1 总RNA的提取。采用改良CTAB法提取总RNA[7]。
1.3.2 RNA反转录。将提取的总RNA用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录成cDNA。
1.3.3 NRT2基因克隆。从基因库中查找到梨的硝酸盐转运酶基因相关序列，并在其保守区域使用软件Primer Premier 5.0进行引物设计（表1）。
3′-RACE和5′-RACE按试剂盒操作步骤进行，经测序、剪接、拼接后获得NRT2基因的cDNA全长序列。
1.3.4 生物信息学分析。蛋白质理化性质在线分析，http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html；蛋白质结构域分析，http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/；疏水性分析，http：//www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl，参数选择，Hphob./ Kyte & Doolittle；磷酸化位点分析，http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/；亚细胞定位分析，http：//psort.hgc.jp/form.html；氨基酸二级结构预测运用PBIL LYON-GERLAND数据库进行在线分析，http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_hnn.html。 2 结果与分析
2.1 总RNA的提取及cDNA检测 从图1可以看出，提取的总RNA有很明显的2个条带，分别是28S和18S，从亮度上可以判断28S带比18S带亮2倍左右，且2个条带后面都没有拖带现象，说明RNA没被降解，完整性较好。
2.2 NRT2基因的克隆
以杜梨cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，结果如图2所示，获得了1条400 bp左右的条带，经测序，NRT2基因片段大小为403 bp，与苹果的MdNRT2.7（Accession：XM_008359511）相似性达90.58%。
用NRT2PR1 out primer与3′-RACE Outer Prime进行第1轮扩增，以其PCR产物为模板，用NRT2PR1 inner primer和3′-RACE Inner Primer为引物进行第2轮扩增，扩增产物经测序，得到大小为744 bp NRT2的3′-RACE序列（图3）。
用5′-NRT2O与UPM Long进行第1轮扩增，以其PCR产物为模板，用5′-NRT2I与UPM Short作为引物进行第2轮扩增，扩增产物经测序，得到大小为313 bp NRT2的5′-RACE序列（图4）。
2.3 杜梨硝酸盐转运酶NRT2基因生物信息学分析
将NRT2基因扩增片段序列、3′-RACE和5′-RACE序列拼接，基因全长1 460 bp，其中编码序列长为1 422 bp，编码473个氨基酸序列。在GenBank上进行Nucleotide Blast比对，与MdNRT2.7硝酸盐转运基因相似性最高，达99%。
將试验得到的NRT2氨基酸序列与基因库中其他植物的转运硝酸盐蛋白进行多重氨基酸序列对比，结果表明杜梨NRT2蛋白与苹果MdNRT2.7蛋白相似度最高（图5），达94.28%。系统进化树显示，杜梨NRT2蛋白首先与苹果MdNRT2.7蛋白聚为一类（图6），因此，克隆的NRT2基因就是杜梨硝酸盐转运基因，将其命名为PbeNRT2。
蛋白质理化性质在线分析结果表明，分子式为C2 346H3 631N589O637S26，相对分子质量为51 112.7，等电点（pI）为7.03。
蛋白质结构域分析结果表明，亮氨酸Leu（12.9%）是含量最高的氨基酸，其次为甘氨酸Gly（9.5%）、丙氨酸Ala（9.3%），最低的是组氨酸His（1.5%）。
蛋白质疏水性分析结果表明，亲水性最强的氨基酸是分值为-2.589的第239位谷氨酸Glu，疏水性最强的氨基酸是分值为3.011的第345位亮氨酸Leu。蛋白质磷酸化位点分析结果表明，蛋白激酶的磷酸化位点可能是1个丝氨酸Ser、1个苏氨酸Thr和2个酪氨酸Tyr。亚细胞定位分析结果表明，该蛋白定位于叶绿体基质的概率为60.0%，定位于叶绿体类囊体膜的概率为45.8%，定位于高尔基体的概率为40.0%，定位于内质网的概率为36.0%，推测该蛋白定位于叶绿体的概率最大。蛋白预测的二级结构由α-螺旋（54.12%）、无规则卷曲（36.58%）和延伸链（9.30%）组成。
3 讨论
根据转运系统的不同可以将植物NO3-转运蛋白基因分为低亲和NO3-转运家族（NRT1）和高亲和NO3-转运家族（NRT2和NAR2）[8-10]。拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AtNRT1家族共有53个成员[11]，参与NO3-转运蛋白基因主要是AtNRT1.1、AtNRT1.2[12-13]。NRT1.1编码1个受硝酸盐诱导的双重亲和的转运蛋白，在低氮和高氮条件下均能较好地吸收NO3-[14]。而NRT1.2编码的是典型的低亲和转运蛋白，主要在根系表皮细胞中表达，在高NO3-浓度下起作用[15]。NRT2在拟南芥有7个家族基因，其中起主要作用的转运蛋白基因是AtNRT2.1和AtNRT2.2[16]。NRT2.1和NRT2.2是植物重要的NO3-转运蛋白基因，在低氮条件下，调控植物根系吸收NO3-[17]。该研究克隆的杜梨PbeNRT2为高亲和性硝酸盐转运酶基因，对于低浓度的NO3-起作用，为今后开展梨树根系氮素的高效利用和分子机理研究提供了基础资料。
参考文献
[1] 鲜开梅.不同氮素水平处理对彩椒植株生长及产量的影响[J].北方园艺，2015（2）：26-29.
[2] CRAWFORD N M，GLASS A D M.Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants[J].Trends in plant science，1998，3（10）：389-395.
[3] MARSCHNER H，RMHELD V，KISSEL M.Different strategies in higher plants in mobilization and uptake of iron[J].Journal of plant nutrition，1986，9（3/4/5/6/7）：695-713.
[4] 肖焱波，李文学，段宗颜，等.植物对硝态氮的吸收及其调控[J].中国农业科技导报，2002，4（2）：56-59.
[5] MORGAN M A，JACKSON W A，VOLK R J.Concenrtationdependence of the nitrate assimilation pathway in maize roots[J].Plant science，1985，38（3）：185-191.
[6] 李秀根.改革开放30年我国梨产业的发展回顾[J].烟台果树，2008，104（4）：4-6. [7] 王西成，喬玉山，欧春青，等.三种梨果皮总RNA提取方法的比较研究[J].甘肃农业大学学报，2010，45（2）：91-94.
[8] FORDE B G.The role of longdistance signalling in plant responses to nitrate and other nutrients[J].Journal of experimental botany，2002，53（366）：39-43.
[9] GANSEL X，MUN～ OS S，TILLARD P，et al.Differential regulation of the NO3- and NH4+ transporter genes AtNrt2.1 and AtAmt1.1 in Arabidopsis：Relation with longdistance and local controls by N status of the plant[J].The plant journal，2001，26（2）：143-155.
[10] GALVN A，FERNNDEZ E.Eukaryotic nitrate and nitrite transporters[J].Cellular and molecular life sciences，2001，58（2）：225-233.
[11] PLETT D，TOUBIA J，GARNETT T，et al.Dichotomy in the NRT gene families of dicots and grass species[J].Plos one，2010，5（12）：15289.
[12] TSAY Y F，SCHROEDER J I，FELDMANN K A，et al.The herbicide sensitivity gene CHL1 of Arabidopsis encodes a nitrateinducible nitrate transporter[J].Cell，1993，72（5）：705-713.
[13] OKAMOTO M，VIDMAR J J，GLASS A D.Regulation of NRT1 and NRT2 gene families of Arabidopsis thaliana：Responses to nitrate provision[J].Plant and cell physiology，2003，44（3）：304-317.
[14] LIU K H，HUANG C Y，TSAY Y F.CHL1 is a dualaffinity nitrate transporter of Arabidopsis involved in multiple phases of nitrate uptake[J].The plant cell，1999，11（5）：865-874.
[15] HUANG N C，LIU K H，LO H J，et al.Cloning and functional characterization of an Arabidopsis nitrate transporter gene that encodes a constitutive component of lowaffinity uptake[J].The plant cell，1999，11（8）：1381-1392.
[16] NAZOA P，VIDMAR J J，TRANBARGER T J，et al.Regulation of the nitrate transporter gene AtNRT2.1 in Arabidopsis thaliana：Responses to nitrate，amino acids and developmental stage[J].Plant molecular biology，2003，52（3）：689-703.
[17] CEREZO M，TILLARD P，FILLEUR S，et al.Major alterations of the regulation of root NO3- uptake are associated with the mutation of Nrt2.1 and Nrt2.2 genes in Arabidopsis[J].Plant physiology，2001，127（1）：262-271.