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摘要 目的：观察去卵巢和地塞米松肌肉注射对大鼠血管钙含量和骨密度的影响。方法：对雌性Wistar大鼠分别进行去卵巢及肌肉注射地塞米松，观察去卵巢及地塞米松肌肉注射对血管钙含量和骨密度的影响。雌性Wistar大鼠共分为4组，即对照组、假手术组、去卵巢组和地米注射组，10周后，进行主动脉钙含量、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）活性及骨钙素（osteocalcin， OC）含量测定，判断血管钙化程度；用骨密度仪测定大鼠骨密度以反映骨质疏松程度。结果：去卵巢组和地米注射组血管钙含量均升高，明显高于对照组和假手术组（P<0.01﹚；两组腰椎骨密度均低于对照组（P<0.01，P<0.05﹚，去卵巢组股骨骨密度亦低于对照组（P<0.05﹚。结论： 去卵巢和肌注地塞米松均可导致大鼠骨密度降低，同时可增加血管钙含量，其机制有待进一步探讨。
关键词： 去卵巢大鼠；地塞米松注射；骨质疏松；血管钙化
血管钙化常发生于动脉粥样硬化性血管病变，也存在于糖尿病、肾病血管病变，高血压等疾病的病理过程中，可导致血栓形成、动脉粥样硬化斑块破裂等严重后果，是心血管疾病的重要危险因素[1]。以往认为血管钙化是钙盐在血管壁的被动沉积，然而近年来许多研究结果显示，血管钙化是一个主动的、可调节的过程，与骨形成过程有许多相似之处[2]。骨质疏松是一种以骨量减少、骨组织微细结构退化为特征，致使骨的脆性增加以及易发生骨折的全身性疾病。令人感兴趣的是，在临床上发现血管钙化与骨质疏松可并存于同一个体[3]，这一矛盾现象的出现，提示两者可能存在某种内在的联系。本研究在去卵巢和地塞米松肌肉注射两种动物模型上，观察两种方法对血管钙含量和骨密度的影响，旨在对临床预防及治疗决策提供理论基础。
1材料与方法
1.1动物分组及造模方法
三月龄健康雌性Wistar大鼠32只，清洁级，体重180-220g，由内蒙古大学实验动物中心提供。随机分为4组（每组8只），对照组：普通饲料喂养，不做特殊处理。假手术组：只切除部分脂肪组织后缝合。去卵巢组：按照文献制备去卵巢大鼠模型[4]。地塞米松组：按文献方法制备[5]。
1.2试剂与药品
地塞米松磷酸钠注射液；骨钙素放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；羟脯氨酸测试盒（南京建成生物制品有限公司）；碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物制品有限公司）。其余试剂均为市售分析纯。
1.3主要仪器
原子吸收分光光度计（JenanovAA300）；双能X线骨密度仪（NORLAND，XR-36）；全自动生化分析仪（BECKMAN）；XH-6080型γ放射免疫计数器；TU-1810紫外可见分光光度计。
1.4取材及标本制备
大鼠共同喂养10周后，注射过量戊巴比妥钠处死动物。处死前置于代谢笼中收集24小时尿液（-20℃保存待测）。断头取血5ml，分离血清（-20℃贮存备用，待测各项生化指标）。迅速剖开动物取胸腹主动脉全长用PBS冲洗后，去除外膜后于-70℃储存备用。取腰椎2-4节段及右股骨全长，清除肌肉及结缔组织后于-40℃保存待测。
1.5血管总钙含量测定
取胸主动脉1cm （约10mg）80℃烤干， 组织称重，加入2mol/L硝酸2ml消化，180℃烤干，冷却后加入去离子水（含27nmol/L的氯化钾和27μmol/L的氯化镧）10ml复溶，取2ml加入1%氯化锶100μl，用原子吸收分光光度计在422.7nm波长处读取吸光度，测定组织的钙含量，并换算成nmol/mg.pr。
1.6血管碱性磷酸酶（ALP）活性测定
取腹主动脉约1cm制备组织匀浆，离心吸取上清液，按药盒说明书操作測定血管组织ALP活性。结果用考马斯亮蓝法测定的总蛋白含量进行标准化，单位为U/mg.pr。
1.7血管骨钙素（OC）放免测定
取腹主动脉约1cm制备组织匀浆，离心后吸取上清液，骨钙素浓度用125I放免法进行测定，结果用考马斯亮蓝法测定的总蛋白含量进行标准化，单位为ng/mg.pr。
1.8骨密度测定
采用双能X线骨密度仪，应用小动物软件测定大鼠右侧股骨及腰椎骨密度。
1.9血液和尿液生化指标测定
血清钙、磷、碱性磷酸酶活性，尿钙、磷、尿肌酐送生化实验室采用全自动生化分析仪测定，各项指标均为集中检测。血清骨钙素、尿羟脯氨酸（HOP）测定参照试剂盒说明进行。
1.10统计学处理
各组实验结果以均数±标准差（x±s）表示。使用SPSS10.0软件进行统计学处理。用单因素方差分析、组间比较用q检验作统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1血管总钙含量、ALP活性和OC含量变化
去卵巢组和地米注射组主动脉总钙含量较对照组分别升高48.1%和50.9%（P<0.01）；两组与假手术组比较也有统计学差异（P<0.01）；去卵巢组主动脉ALP活性较对照组降低60.2%（P<0.05）；地米注射组主动脉OC含量较对照组降低47.5%（P<0.05）；见表1。
2.2骨密度测定结果
去卵巢组股骨骨密度较对照组降低15.7%（P<0.05），腰椎骨密度较对照组降低25.6%（P<0.01）；地米注射组腰椎和股骨骨密度均较对照组降低（P<0.05，P>0.05）；去卵巢组腰椎较地米注射组降低（P<0.01）。见表2。
2.3血清生化检测结果
地米组血清胆碱酯酶较对照组和假手术组明显降低（P<0.01），去卵巢组低于假手术组（P<0.05）；血清钙各组比较无统计学差异（P>0.05）；地米组血清磷高于对照组（P<0.05）；去卵巢组和地米组血清骨钙素均高于假手术组和对照组（P<0.05）；去卵巢组血清ALP明显高于对照组和假手术组（P<0.01），也高于地米组（P<0.05），地米组高于假手术组和对照组（P<0.05，P<0.01）；见表3。 2.4 24小时尿生化检测结果
各组大鼠尿钙/肌酐、尿磷/肌酐及尿HOP/肌酐比较均无统计学差异（P>0.05）；见表4。
3 讨论
骨质疏松症是老年人的常见病，尤其多见于绝经期妇女和长期服用糖皮质激素的患者。糖皮质激素导致的骨质疏松是最常见的一种继发性骨质疏松。长期和过量使用糖皮质激素（如地塞米松）所致的骨质疏松症，仅次于绝经后雌激素缺乏引起的骨质疏松症。值得注意的是在临床上发现血管钙化常与骨质疏松症常常并存于同一个体，提示这两种疾病可能存在着某种联系。本研究通过将雌性大鼠去卵巢和肌注地塞米松，观察该两种模型对血管钙含量和骨密度的影响。
3.1 两种大鼠模型血管钙含量的变化
碱性磷酸酶（ALP）是基质小泡的重要组成，组织非特异性ALP存在于全身的血管中，是钙盐形成过程中重要的酶。ALP作为成骨细胞早期分化标志物，对骨化作用是不可或缺的。文献报道在血管钙化部位ALP活性增加，可能对血管钙化的发生具有重要的调节作用[6]。
骨钙素（OC）又称骨Gla蛋白（BGP），主要在骨骼中的成骨细胞和骨细胞合成及分泌，是成骨细胞晚期分化标志物，属于-羧基谷氨酸蛋白家族，最初由骨组织中分离出来，在骨组织钙化中起重要的作用。在正常的动脉组织中没有OC表达，但在血管钙化过程中其分泌增加，且分泌的程度与钙化呈正相关。有研究发现在发生钙化的粥样斑块中可检测到OC[7]。
本研究结果显示，去卵巢和肌肉注射地塞米松后，大鼠主动脉钙含量均明显增加，高于对照组和假手术组（P<0.01），提示有血管钙化出现。但由于造模时间较短，因此，成骨细胞早期和晚期分化标志物ALP和OC均未出现增加，反而有减少，提示去卵巢和肌注地塞米松引起的血管钙化在早期可能并未引起骨代谢标志物在血管局部表达增加。
3.2 两种大鼠模型骨质疏松特点
骨质疏松以骨量减少、骨微观结构退化为特征。临床上一般通过骨密度测量结合血、尿生化指标进行诊断。判定骨质疏松模型是否复制成功，主要取决于动物骨量丢失是否具有统计学意义[8]。本实验发现去卵巢和地塞米松肌肉注射10周后，两种模型组腰椎骨密度较对照组均减低（P<0.01，P<0.05）， 其中去卵巢组股骨骨密度较对照组也有降低（P<0.05），表明两种模型大鼠骨量均减少，即骨质疏松模型复制成功，且去卵巢对大鼠骨密度的影响更明显。
3.3血清生化指标变化及其意义
动物骨代谢生化指标的改变要比骨密度改变明显，可以将二者联合，作为判断骨质丢失的指标。在本研究中反映骨形成的指标主要有血清骨钙素和ALP；反映骨吸收的指标则是尿羟脯氨酸。
本实验中4组动物的血清钙、磷无显著性差异（P>0.05）；血清胆碱酯酶在去卵巢组和地米注射组均有降低，尤其是地米注射組，血清胆碱酯酶明显低于对照组和假手术组（P<0.01），显示有明显的肝功能损害。反映骨形成的指标血清骨钙素和ALP在去卵巢组和地米注射组均高于对照组（P<0.05，P<0.01）；而骨吸收的指标尿HOP/肌酐四组比较无显著性差异；该结果表明，在去卵巢和地米注射所致的骨质疏松模型中，骨代谢明显增强，在早期可出现血清骨形成指标的增加。
本实验研究首次在两种骨质疏松动物模型上，探讨对于血管钙含量的影响和骨质疏松的特点。结果显示去卵巢和肌肉注射地塞米松均可造成大鼠主动脉钙化形成，也可引起腰椎和股骨骨密度的下降，提示该两种因素既可以促进血管钙化，也可降低骨密度，其作用机制需要进一步深入的研究加以阐明。
参 考 文 献
[1] Wallin R， Wajih N， Greenwood G T， et al. Arterial calcification： a review of mechanisms， animal models， and the prospects for therapy. Med Res Rev， 2001， 21 （4）： 274-301.
[2] Son BK， Akishita M. Mechanism of vascular calcification[J].Clin Calcium， 2007， 17（3）：319-332.
[3] Naves M， Rodriguez-Garcia， Diaz-Lopez JB， et al. Progression of vascular calcifications is associated with greater bone loss and increased bone fractures[J]. Osteoporos Int， 2008， 19（8）：1161-1166.
[4] Park JH， Omi N， Iemitsu M， et al. Relationship between arterial calcification and bone loss in a new combined model rat by ovariectomy and vitamin（3） plus nicotine[J]. Calcif Tissue Int， 2008，83（3）：192-201.
[5] 廖慧娟，廖二元.骨质疏松症动物模型[J].国外医学：内分泌学分册，2004，24（1）：60-62.
[6] Jono S， McKee MD， Murry CE， et al. Phosphate regulation of vascularsmooth muscle cell calcification. Circ Res. 2000； 87：10-17.
[7] Canalis E，Pereira RC，De lany AM.Efects of glucocorticoids on the skeleton Pediatr Endocrinol Metab，2002，15（Suppl 5）：1341-1345.
[8] 冼华，曹文富.血中骨代谢生化指标在骨质疏松症诊治中的意义. 中国骨质疏松杂志2007，13（1）：69-71.
关键词： 去卵巢大鼠；地塞米松注射；骨质疏松；血管钙化
血管钙化常发生于动脉粥样硬化性血管病变，也存在于糖尿病、肾病血管病变，高血压等疾病的病理过程中，可导致血栓形成、动脉粥样硬化斑块破裂等严重后果，是心血管疾病的重要危险因素[1]。以往认为血管钙化是钙盐在血管壁的被动沉积，然而近年来许多研究结果显示，血管钙化是一个主动的、可调节的过程，与骨形成过程有许多相似之处[2]。骨质疏松是一种以骨量减少、骨组织微细结构退化为特征，致使骨的脆性增加以及易发生骨折的全身性疾病。令人感兴趣的是，在临床上发现血管钙化与骨质疏松可并存于同一个体[3]，这一矛盾现象的出现，提示两者可能存在某种内在的联系。本研究在去卵巢和地塞米松肌肉注射两种动物模型上，观察两种方法对血管钙含量和骨密度的影响，旨在对临床预防及治疗决策提供理论基础。
1材料与方法
1.1动物分组及造模方法
三月龄健康雌性Wistar大鼠32只，清洁级，体重180-220g，由内蒙古大学实验动物中心提供。随机分为4组（每组8只），对照组：普通饲料喂养，不做特殊处理。假手术组：只切除部分脂肪组织后缝合。去卵巢组：按照文献制备去卵巢大鼠模型[4]。地塞米松组：按文献方法制备[5]。
1.2试剂与药品
地塞米松磷酸钠注射液；骨钙素放免试剂盒（北京北方生物技术研究所）；羟脯氨酸测试盒（南京建成生物制品有限公司）；碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物制品有限公司）。其余试剂均为市售分析纯。
1.3主要仪器
原子吸收分光光度计（JenanovAA300）；双能X线骨密度仪（NORLAND，XR-36）；全自动生化分析仪（BECKMAN）；XH-6080型γ放射免疫计数器；TU-1810紫外可见分光光度计。
1.4取材及标本制备
大鼠共同喂养10周后，注射过量戊巴比妥钠处死动物。处死前置于代谢笼中收集24小时尿液（-20℃保存待测）。断头取血5ml，分离血清（-20℃贮存备用，待测各项生化指标）。迅速剖开动物取胸腹主动脉全长用PBS冲洗后，去除外膜后于-70℃储存备用。取腰椎2-4节段及右股骨全长，清除肌肉及结缔组织后于-40℃保存待测。
1.5血管总钙含量测定
取胸主动脉1cm （约10mg）80℃烤干， 组织称重，加入2mol/L硝酸2ml消化，180℃烤干，冷却后加入去离子水（含27nmol/L的氯化钾和27μmol/L的氯化镧）10ml复溶，取2ml加入1%氯化锶100μl，用原子吸收分光光度计在422.7nm波长处读取吸光度，测定组织的钙含量，并换算成nmol/mg.pr。
1.6血管碱性磷酸酶（ALP）活性测定
取腹主动脉约1cm制备组织匀浆，离心吸取上清液，按药盒说明书操作測定血管组织ALP活性。结果用考马斯亮蓝法测定的总蛋白含量进行标准化，单位为U/mg.pr。
1.7血管骨钙素（OC）放免测定
取腹主动脉约1cm制备组织匀浆，离心后吸取上清液，骨钙素浓度用125I放免法进行测定，结果用考马斯亮蓝法测定的总蛋白含量进行标准化，单位为ng/mg.pr。
1.8骨密度测定
采用双能X线骨密度仪，应用小动物软件测定大鼠右侧股骨及腰椎骨密度。
1.9血液和尿液生化指标测定
血清钙、磷、碱性磷酸酶活性，尿钙、磷、尿肌酐送生化实验室采用全自动生化分析仪测定，各项指标均为集中检测。血清骨钙素、尿羟脯氨酸（HOP）测定参照试剂盒说明进行。
1.10统计学处理
各组实验结果以均数±标准差（x±s）表示。使用SPSS10.0软件进行统计学处理。用单因素方差分析、组间比较用q检验作统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1血管总钙含量、ALP活性和OC含量变化
去卵巢组和地米注射组主动脉总钙含量较对照组分别升高48.1%和50.9%（P<0.01）；两组与假手术组比较也有统计学差异（P<0.01）；去卵巢组主动脉ALP活性较对照组降低60.2%（P<0.05）；地米注射组主动脉OC含量较对照组降低47.5%（P<0.05）；见表1。
2.2骨密度测定结果
去卵巢组股骨骨密度较对照组降低15.7%（P<0.05），腰椎骨密度较对照组降低25.6%（P<0.01）；地米注射组腰椎和股骨骨密度均较对照组降低（P<0.05，P>0.05）；去卵巢组腰椎较地米注射组降低（P<0.01）。见表2。
2.3血清生化检测结果
地米组血清胆碱酯酶较对照组和假手术组明显降低（P<0.01），去卵巢组低于假手术组（P<0.05）；血清钙各组比较无统计学差异（P>0.05）；地米组血清磷高于对照组（P<0.05）；去卵巢组和地米组血清骨钙素均高于假手术组和对照组（P<0.05）；去卵巢组血清ALP明显高于对照组和假手术组（P<0.01），也高于地米组（P<0.05），地米组高于假手术组和对照组（P<0.05，P<0.01）；见表3。 2.4 24小时尿生化检测结果
各组大鼠尿钙/肌酐、尿磷/肌酐及尿HOP/肌酐比较均无统计学差异（P>0.05）；见表4。
3 讨论
骨质疏松症是老年人的常见病，尤其多见于绝经期妇女和长期服用糖皮质激素的患者。糖皮质激素导致的骨质疏松是最常见的一种继发性骨质疏松。长期和过量使用糖皮质激素（如地塞米松）所致的骨质疏松症，仅次于绝经后雌激素缺乏引起的骨质疏松症。值得注意的是在临床上发现血管钙化常与骨质疏松症常常并存于同一个体，提示这两种疾病可能存在着某种联系。本研究通过将雌性大鼠去卵巢和肌注地塞米松，观察该两种模型对血管钙含量和骨密度的影响。
3.1 两种大鼠模型血管钙含量的变化
碱性磷酸酶（ALP）是基质小泡的重要组成，组织非特异性ALP存在于全身的血管中，是钙盐形成过程中重要的酶。ALP作为成骨细胞早期分化标志物，对骨化作用是不可或缺的。文献报道在血管钙化部位ALP活性增加，可能对血管钙化的发生具有重要的调节作用[6]。
骨钙素（OC）又称骨Gla蛋白（BGP），主要在骨骼中的成骨细胞和骨细胞合成及分泌，是成骨细胞晚期分化标志物，属于-羧基谷氨酸蛋白家族，最初由骨组织中分离出来，在骨组织钙化中起重要的作用。在正常的动脉组织中没有OC表达，但在血管钙化过程中其分泌增加，且分泌的程度与钙化呈正相关。有研究发现在发生钙化的粥样斑块中可检测到OC[7]。
本研究结果显示，去卵巢和肌肉注射地塞米松后，大鼠主动脉钙含量均明显增加，高于对照组和假手术组（P<0.01），提示有血管钙化出现。但由于造模时间较短，因此，成骨细胞早期和晚期分化标志物ALP和OC均未出现增加，反而有减少，提示去卵巢和肌注地塞米松引起的血管钙化在早期可能并未引起骨代谢标志物在血管局部表达增加。
3.2 两种大鼠模型骨质疏松特点
骨质疏松以骨量减少、骨微观结构退化为特征。临床上一般通过骨密度测量结合血、尿生化指标进行诊断。判定骨质疏松模型是否复制成功，主要取决于动物骨量丢失是否具有统计学意义[8]。本实验发现去卵巢和地塞米松肌肉注射10周后，两种模型组腰椎骨密度较对照组均减低（P<0.01，P<0.05）， 其中去卵巢组股骨骨密度较对照组也有降低（P<0.05），表明两种模型大鼠骨量均减少，即骨质疏松模型复制成功，且去卵巢对大鼠骨密度的影响更明显。
3.3血清生化指标变化及其意义
动物骨代谢生化指标的改变要比骨密度改变明显，可以将二者联合，作为判断骨质丢失的指标。在本研究中反映骨形成的指标主要有血清骨钙素和ALP；反映骨吸收的指标则是尿羟脯氨酸。
本实验中4组动物的血清钙、磷无显著性差异（P>0.05）；血清胆碱酯酶在去卵巢组和地米注射组均有降低，尤其是地米注射組，血清胆碱酯酶明显低于对照组和假手术组（P<0.01），显示有明显的肝功能损害。反映骨形成的指标血清骨钙素和ALP在去卵巢组和地米注射组均高于对照组（P<0.05，P<0.01）；而骨吸收的指标尿HOP/肌酐四组比较无显著性差异；该结果表明，在去卵巢和地米注射所致的骨质疏松模型中，骨代谢明显增强，在早期可出现血清骨形成指标的增加。
本实验研究首次在两种骨质疏松动物模型上，探讨对于血管钙含量的影响和骨质疏松的特点。结果显示去卵巢和肌肉注射地塞米松均可造成大鼠主动脉钙化形成，也可引起腰椎和股骨骨密度的下降，提示该两种因素既可以促进血管钙化，也可降低骨密度，其作用机制需要进一步深入的研究加以阐明。
参 考 文 献
[1] Wallin R， Wajih N， Greenwood G T， et al. Arterial calcification： a review of mechanisms， animal models， and the prospects for therapy. Med Res Rev， 2001， 21 （4）： 274-301.
[2] Son BK， Akishita M. Mechanism of vascular calcification[J].Clin Calcium， 2007， 17（3）：319-332.
[3] Naves M， Rodriguez-Garcia， Diaz-Lopez JB， et al. Progression of vascular calcifications is associated with greater bone loss and increased bone fractures[J]. Osteoporos Int， 2008， 19（8）：1161-1166.
[4] Park JH， Omi N， Iemitsu M， et al. Relationship between arterial calcification and bone loss in a new combined model rat by ovariectomy and vitamin（3） plus nicotine[J]. Calcif Tissue Int， 2008，83（3）：192-201.
[5] 廖慧娟，廖二元.骨质疏松症动物模型[J].国外医学：内分泌学分册，2004，24（1）：60-62.
[6] Jono S， McKee MD， Murry CE， et al. Phosphate regulation of vascularsmooth muscle cell calcification. Circ Res. 2000； 87：10-17.
[7] Canalis E，Pereira RC，De lany AM.Efects of glucocorticoids on the skeleton Pediatr Endocrinol Metab，2002，15（Suppl 5）：1341-1345.
[8] 冼华，曹文富.血中骨代谢生化指标在骨质疏松症诊治中的意义. 中国骨质疏松杂志2007，13（1）：69-71.