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摘要 [目的]用生物信息学手段分析、预测毛白杨PLC2基因/蛋白质的结构与特征，为该基因的克隆及功能研究提供理论参考。[方法]以PLC2基因及对应蛋白质为研究对象，利用各种网上数据库及生物信息学分析软件对其进行相关分析、预测。[结果]PLC2基因的GenBank登录号为JX424764.1，ORF长957bp，编码318个氨基酸，对应蛋白质PLC2的分子量35 999.1D，理论等电点7.07；PLC2与毛果杨（XP_002313726.1）的同源性较高；PLC2属于PIPLCc_GDPD_SF超家族，无O糖基化位点，无二硫键，无跨膜区和信号肽，有16个磷酸化位点。[结论]对PLC2基因/蛋白的各级结构及功能进行预测，为下一步试验奠定基础。
关键词 毛白杨；磷酸肌醇特异性磷脂酶C；生物信息学
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）31-10867-06
Bioinformatics Analysis of Populus tomentosa cultivar BJHR01 Phosphoinositidespecific phospholipase C （PLC2） Gene
LI Moye， ZHAO Hui， JIANG Yang， LI Kailong et al
（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）
Abstract [Objective] To analyze and predict the structure and feature of Populus tomentosa PLC2 gene/protein through bioinformatics method， and provide theoretical foundation for gene cloning and function research. [Method] Utilize various online databases and bioinformatics software to predict PLC2 gene and its corresponding protein. [Result] The GenBank accession number of PLC2 is JX424764.1， ORF is 957bp in length， encoding 318aa； the molecular weight of PLC2 is 35 999.1D， theoretical isoelectric point is 7.07； PLC2 has a higher homology with XP_002313726.1， belonging to PIPLCc_GDPD_SF superfamily， has no Oglycosylation site， no disulfide bond， no transmembrane domain or signal peptide， but 16 phosphorylation sites. [Conclusion] This study has predicted the structure and function of PLC2 gene/protein and paved the way for the following experiments.
Key words Populus tomentosa； Phosphoinositidespecific phospholipase C； Bioinformatics
毛白楊（Populus tomentosa）是以黄河中、下游流域为中心而广泛分布的杨柳科落叶乔木，该树种适应能力较强，是速生用材林，为防护林和行道河渠绿化的理想选择[1]。磷酸肌醇特异性磷脂酶C是真核生物胞内酶，在细胞信号转导过程中起着重要作用[2]。它能催化1磷脂酶D肌醇肌糖4，5二磷酸水解成第二信使物质甘油二脂、肌糖1，4，5三磷酸的反应，这个催化作用还受到可逆磷酸化反应以及调节蛋白质的调控[3-5]。笔者通过生物信息学手段对毛白杨（BJHR01种）磷酸肌醇特异性磷脂酶C（phosphoinositidespecific phospholipase C，PLC2）基因的核酸/蛋白质序列的分子特征、一级结构、二级结构以及三维结构进行了预测，并对该蛋白进行了系统进化分析，从而为下一步的分子生物学试验提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
所选材料为毛白杨（BJHR01种）磷酸肌醇特异性磷脂酶C基因，GenBank登录号：JX424764.1。
1.2 方法
利用BioEditClustalW软件对11个物种的磷酸肌醇特异性磷脂酶氨基酸序列进行多序列比对；应用MEGA5软件构建系统进化树；利用ExPASy中的ProtParam工具（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）对蛋白质的理化性质进行在线分析；通过NetOGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）进行糖基化位点的预测；通过NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）对PLC 2的磷酸化位点进行预测；利用在线工具COILS预测PLC2的卷曲螺旋结构；利用PredictProtein和psipred预测PLC2蛋白的二级结构；利用PROSITE（http：//prosite.expasy.org/）确定出PLC 2的活性部位；利用在线工具PredictProtein（http：//www.Predictprotein.org/）和 TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）方法预测PLC2氨基酸序列可能的跨膜区；应用SignalP在线预测毛白杨磷酸肌醇特异性磷脂酶C的信号肽；利用SWISS MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）预测PLC2蛋白质的三级结构；用Raswin和spdbiew软件查看三级结构预测结果。 2 结果与分析
2.1 PLC2基因及相應氨基酸序列的一级结构
2.1.1 plc2基因的开放读码框及翻译。
首先检索NCBI中的GenBank获得PLC2基因的完整cds，再利用ORF Finder查找其开放读码框，获得一条长957 bp的完整ORF，利用SMS在线翻译（+1框）该核酸序列，结果见图1。
2.1.2 plc2基因的染色体定位。
利用NCBI中的工具MapViewer初步检索毛果杨基因组，使用普通检索和高级检索，均未找到与之匹配的结果。于JGI数据库进行BLAT Search，结果发现在毛果杨的第9号和第4号染色体上的得分最高，分别为1 583.0、1 825.0，相似程度分别为90.6%、98.7%（图2）。由于毛果杨与毛白杨亲缘关系较近，因此推测PLC2基因可能位于毛白杨栽培种BJHR01的第4或第9号染色体上。
2.1.3 氨基酸序列分析。
经过ExPASy在线软件分析，得出PLC2氨基酸数目为318，相对分子质量为35 999.1 D，理论等电点（pI）为7.07。在PLC2中，亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）和缬氨酸（Val）3种氨基酸含量最高，均为7.5%。甲硫氨酸含量最低（Met），仅为1.3%（图3）。PLC2蛋白原子组成为C∶H∶N∶O∶S=1 603∶2 530∶440∶478∶12，即分子式为C1603H2530N440O478S12，原子总数为5 063。不稳定系数为38.26。
2.1.4 PLC2的亲疏水性分析。
利用ProtScale软件绘制毛白杨磷酸肌醇特异性磷脂酶C亲疏水性列谱，以预测其折叠情况。使用Hphob./Kyte&Doolittle算法进行预测，见图4。结果发现，该蛋白质仅存在1个高分值峰（Score>1.5），分布在第300～310位残基之间；而3个低分值（Score<0）的峰分别位于第40～50、150～160、190～200氨基酸残基位点附近，可初步推测这3个位置为蛋白质的卷曲结构部位。
3 讨论
该研究通过生物信息学的方法对PLC2基因的DNA序列、蛋白质序列进行了分析，并预测了相应蛋白质的结构与功能。利用PROSITE预测出该蛋白的保守结构域为PIPLC_X_DOMAIN，位于第57～185位氨基酸残基之间，其中以2个组氨酸（H）为活性中心位点，即为该酶的催化活性中心。序列比对表明，PLC2的PIPLC_X_DOMAIN结构域在不同物种中具有很高的保守型。蛋白质的结构分析显示该酶无卷曲结构，无二硫键，无明显的跨膜区，且未预测出信号肽。笔者还利用SWISS MODEL（Automated Mode）预测了PLC2的三维构型，结果表明，QMEAN Z-Score=-6.19，与模板蛋白序列比对的一致性也非常低（14.92%），说明预测结果可信度不高，原因可能是该蛋白质本身不稳定或是所选靶标蛋白不当，下一步通过Robetta BETA从头预测PLC2蛋白的三级结构。
另外，笔者通过研究发现，使用不同的分析工具对同一条序列进行分析，可能会得到不同的结果，这可能是因为不同的软件所应用的计算方法各异。因此，该研究对PLC2/PLC2的所有预测结果仅能作为参考，具体功能研究还需要经过大量严谨的试验进行验证。
参考文献
[1]
张美霞，马海燕.毛白杨栽培技术及应用[J].现代农业科技.2014（3）：45
[2] MELDRUM E，PARKER P J，CAROZZI A.The PtdInsPLC superfamily and signal transduction[J].Biochim Biophys Acta，1991，1092（1）：49-71.
[3] RHEE S G，CHOI K D.Multiple forms of phospholipase C isozymes and their activation mechanisms[J].Adv Second Messenger Phosphoprotein Res，1992，26：35-61.
[4] RHEE S G，CHOI K D.Regulation of inositol phospholipidspecific phospholipase C isozymes[J].J Biol Chem，1992，267（18）：12393-12396.
[5] STERNWEIS P C，SMRCKA A V.Regulation of phospholipase C by G proteins[J].Trends Biochem Sci，1992，17（12）：502-506.
[6] 朱琍燕，吴士良.蛋白质的糖基化作用分类及相关数据库[J].生命的化学，2007（2）：108-111.
[7] RHEE S G，BAE Y S.Regulation of phosphoinositidespecific phospholipase C isozymes[J].J Biol Chem，1997，272（24）：15045-15048.
[8] REBECCHI M J，PENTYALA S N.Structure，function，and control of phosphoinositidespecific phospholipase C[J].Physiol Rev，2000，80（4）：1291-1335.
[9] MCGUFFIN L J，BRYSON K，JONES D T.The PSIPRED protein structure prediction server[J].Bioinformatics，2000，16（4）：404-405.
关键词 毛白杨；磷酸肌醇特异性磷脂酶C；生物信息学
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）31-10867-06
Bioinformatics Analysis of Populus tomentosa cultivar BJHR01 Phosphoinositidespecific phospholipase C （PLC2） Gene
LI Moye， ZHAO Hui， JIANG Yang， LI Kailong et al
（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）
Abstract [Objective] To analyze and predict the structure and feature of Populus tomentosa PLC2 gene/protein through bioinformatics method， and provide theoretical foundation for gene cloning and function research. [Method] Utilize various online databases and bioinformatics software to predict PLC2 gene and its corresponding protein. [Result] The GenBank accession number of PLC2 is JX424764.1， ORF is 957bp in length， encoding 318aa； the molecular weight of PLC2 is 35 999.1D， theoretical isoelectric point is 7.07； PLC2 has a higher homology with XP_002313726.1， belonging to PIPLCc_GDPD_SF superfamily， has no Oglycosylation site， no disulfide bond， no transmembrane domain or signal peptide， but 16 phosphorylation sites. [Conclusion] This study has predicted the structure and function of PLC2 gene/protein and paved the way for the following experiments.
Key words Populus tomentosa； Phosphoinositidespecific phospholipase C； Bioinformatics
毛白楊（Populus tomentosa）是以黄河中、下游流域为中心而广泛分布的杨柳科落叶乔木，该树种适应能力较强，是速生用材林，为防护林和行道河渠绿化的理想选择[1]。磷酸肌醇特异性磷脂酶C是真核生物胞内酶，在细胞信号转导过程中起着重要作用[2]。它能催化1磷脂酶D肌醇肌糖4，5二磷酸水解成第二信使物质甘油二脂、肌糖1，4，5三磷酸的反应，这个催化作用还受到可逆磷酸化反应以及调节蛋白质的调控[3-5]。笔者通过生物信息学手段对毛白杨（BJHR01种）磷酸肌醇特异性磷脂酶C（phosphoinositidespecific phospholipase C，PLC2）基因的核酸/蛋白质序列的分子特征、一级结构、二级结构以及三维结构进行了预测，并对该蛋白进行了系统进化分析，从而为下一步的分子生物学试验提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
所选材料为毛白杨（BJHR01种）磷酸肌醇特异性磷脂酶C基因，GenBank登录号：JX424764.1。
1.2 方法
利用BioEditClustalW软件对11个物种的磷酸肌醇特异性磷脂酶氨基酸序列进行多序列比对；应用MEGA5软件构建系统进化树；利用ExPASy中的ProtParam工具（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）对蛋白质的理化性质进行在线分析；通过NetOGlyc（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）进行糖基化位点的预测；通过NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）对PLC 2的磷酸化位点进行预测；利用在线工具COILS预测PLC2的卷曲螺旋结构；利用PredictProtein和psipred预测PLC2蛋白的二级结构；利用PROSITE（http：//prosite.expasy.org/）确定出PLC 2的活性部位；利用在线工具PredictProtein（http：//www.Predictprotein.org/）和 TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）方法预测PLC2氨基酸序列可能的跨膜区；应用SignalP在线预测毛白杨磷酸肌醇特异性磷脂酶C的信号肽；利用SWISS MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）预测PLC2蛋白质的三级结构；用Raswin和spdbiew软件查看三级结构预测结果。 2 结果与分析
2.1 PLC2基因及相應氨基酸序列的一级结构
2.1.1 plc2基因的开放读码框及翻译。
首先检索NCBI中的GenBank获得PLC2基因的完整cds，再利用ORF Finder查找其开放读码框，获得一条长957 bp的完整ORF，利用SMS在线翻译（+1框）该核酸序列，结果见图1。
2.1.2 plc2基因的染色体定位。
利用NCBI中的工具MapViewer初步检索毛果杨基因组，使用普通检索和高级检索，均未找到与之匹配的结果。于JGI数据库进行BLAT Search，结果发现在毛果杨的第9号和第4号染色体上的得分最高，分别为1 583.0、1 825.0，相似程度分别为90.6%、98.7%（图2）。由于毛果杨与毛白杨亲缘关系较近，因此推测PLC2基因可能位于毛白杨栽培种BJHR01的第4或第9号染色体上。
2.1.3 氨基酸序列分析。
经过ExPASy在线软件分析，得出PLC2氨基酸数目为318，相对分子质量为35 999.1 D，理论等电点（pI）为7.07。在PLC2中，亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）和缬氨酸（Val）3种氨基酸含量最高，均为7.5%。甲硫氨酸含量最低（Met），仅为1.3%（图3）。PLC2蛋白原子组成为C∶H∶N∶O∶S=1 603∶2 530∶440∶478∶12，即分子式为C1603H2530N440O478S12，原子总数为5 063。不稳定系数为38.26。
2.1.4 PLC2的亲疏水性分析。
利用ProtScale软件绘制毛白杨磷酸肌醇特异性磷脂酶C亲疏水性列谱，以预测其折叠情况。使用Hphob./Kyte&Doolittle算法进行预测，见图4。结果发现，该蛋白质仅存在1个高分值峰（Score>1.5），分布在第300～310位残基之间；而3个低分值（Score<0）的峰分别位于第40～50、150～160、190～200氨基酸残基位点附近，可初步推测这3个位置为蛋白质的卷曲结构部位。
3 讨论
该研究通过生物信息学的方法对PLC2基因的DNA序列、蛋白质序列进行了分析，并预测了相应蛋白质的结构与功能。利用PROSITE预测出该蛋白的保守结构域为PIPLC_X_DOMAIN，位于第57～185位氨基酸残基之间，其中以2个组氨酸（H）为活性中心位点，即为该酶的催化活性中心。序列比对表明，PLC2的PIPLC_X_DOMAIN结构域在不同物种中具有很高的保守型。蛋白质的结构分析显示该酶无卷曲结构，无二硫键，无明显的跨膜区，且未预测出信号肽。笔者还利用SWISS MODEL（Automated Mode）预测了PLC2的三维构型，结果表明，QMEAN Z-Score=-6.19，与模板蛋白序列比对的一致性也非常低（14.92%），说明预测结果可信度不高，原因可能是该蛋白质本身不稳定或是所选靶标蛋白不当，下一步通过Robetta BETA从头预测PLC2蛋白的三级结构。
另外，笔者通过研究发现，使用不同的分析工具对同一条序列进行分析，可能会得到不同的结果，这可能是因为不同的软件所应用的计算方法各异。因此，该研究对PLC2/PLC2的所有预测结果仅能作为参考，具体功能研究还需要经过大量严谨的试验进行验证。
参考文献
[1]
张美霞，马海燕.毛白杨栽培技术及应用[J].现代农业科技.2014（3）：45
[2] MELDRUM E，PARKER P J，CAROZZI A.The PtdInsPLC superfamily and signal transduction[J].Biochim Biophys Acta，1991，1092（1）：49-71.
[3] RHEE S G，CHOI K D.Multiple forms of phospholipase C isozymes and their activation mechanisms[J].Adv Second Messenger Phosphoprotein Res，1992，26：35-61.
[4] RHEE S G，CHOI K D.Regulation of inositol phospholipidspecific phospholipase C isozymes[J].J Biol Chem，1992，267（18）：12393-12396.
[5] STERNWEIS P C，SMRCKA A V.Regulation of phospholipase C by G proteins[J].Trends Biochem Sci，1992，17（12）：502-506.
[6] 朱琍燕，吴士良.蛋白质的糖基化作用分类及相关数据库[J].生命的化学，2007（2）：108-111.
[7] RHEE S G，BAE Y S.Regulation of phosphoinositidespecific phospholipase C isozymes[J].J Biol Chem，1997，272（24）：15045-15048.
[8] REBECCHI M J，PENTYALA S N.Structure，function，and control of phosphoinositidespecific phospholipase C[J].Physiol Rev，2000，80（4）：1291-1335.
[9] MCGUFFIN L J，BRYSON K，JONES D T.The PSIPRED protein structure prediction server[J].Bioinformatics，2000，16（4）：404-405.