探讨沉默信息调节因子1(SIRT1）在结肠癌耐药中的作用及其可能机制。
方法回顾性分析2012年12月至2013年12月河南省肿瘤医院收治的25例5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗耐药结肠癌患者和30例化疗敏感患者的临床资料。收集患者手术切除的结肠癌标本进行研究。 （1）采用免疫组织化学染色检测化疗耐药和化疗敏感结肠癌患者的结肠癌组织中SIR1T蛋白表达。RT-PCR检测结肠癌细胞HCT116（以下简称HCT116细胞）和耐药结肠癌细胞HCT116/ 5-FU（以下简称HCT116/ 5-FU细胞）中SIRT1 mRNA。 Western blot检测2种细胞中SIRT1蛋白表达。 （2）细胞分组：①将HCT116/ 5-FU细胞进行siRNA干扰：空白对照组（细胞不做任何处理）、空载体组（细胞转染对照siRNA）和SIRT1沉默组（细胞转染SIRT1 siRNA）。②将HCT116/ 5-FU细胞进行JNK蛋白抑制剂处理：SP600125组（浓度为30 μmol/ L的JNK蛋白抑制剂SP60012处理12 h），DMSO组（0.1% DMSO处理12 h）以及对照组（加入等量细胞培养液）。③将HCT116/ 5-FU细胞中SIRT147位点丝氨酸突变成丙氨酸或天冬氨酸，获得突变体分别为S47A组和S47D组，以未转染的野生型细胞作为S47野生型组，并以转染空载体apCMV-3Tag-3细胞为阴性对照，均采用8 μmol/ L的5-FU干预12 h。 （3）分别采用0、1、10、50、100 nmol/ L SIRT1激动剂白藜芦醇和0、1、2、3、4、5 ng/ L SIRT1抑制剂尼克酰胺处理HTC116和HTC116/ 5-FU细胞。MTT法检测细胞增殖率。（4）流式细胞仪检测细胞凋亡。 （5）RT-PCR检测相关基因的表达情况。 （6）Western blot检测各组细胞相关蛋白的表达情况。计数资料比较采用χ2检验，正态分布的计量资料以
±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用LSD-t检验，两两比较采用t检验。
（1）免疫组织化学染色检测结果显示：化疗敏感和化疗耐药结肠癌患者结肠癌组织中SIRT1阳性表达率分别为16.7% （5/ 30）和92.0% （23/ 25），两组比较，差异有统计学意义（χ2＝30.965，P<0.05）。HCT116/ 5-FU细胞中SIRT1 mRNA和蛋白相对表达水平分别为1.870±0.100和1.660±0.109，均显著高于HCT116细胞的1.000 ±0.070和1.000±0.050，两者比较，差异均有统计学意义（t＝11.721, 8.963，P<0.05）。 （2) MTT检测细胞增殖率结果：HCT116/ 5-FU细胞在0、1、10、50 nmol/ L白藜芦醇处理下的细胞增殖率分别为100% ±12%、105% ± 14%、129%±10%、144%±17%，均高于对应浓度处理的HCT116细胞增殖率41% ±10%、49% ±11%、74% ± 16%、105%±17%，两者比较，差异均有统计学意义（t ＝8.226，－7.236, 6.673, 3.510，P<0.05）。HCT116／5-FU细胞在0、1、2 ng/ L尼克酰胺处理下的细胞增殖率分别为87%±12%、78%±12%、69%±11%，均高于对应浓度处理的HCT116细胞增殖率36% ± 6%、32% ± 5%、30% ± 6%，两者比较，差异均有统计学意义（t＝－8.593，－8.006，－7.000，P<0.05）。空白对照组、空载体组和SIRT1沉默组HCT116/ 5-FU细胞增殖率分别为100%±8%、99%±9%、37%±6%，3组比较，差异有统计学意义（F＝66.597，P <0.05），SIRT1沉默组细胞增殖率低于空白对照组，两组比较，差异有统计学意义（t＝10.113，P<0.05）。 （3）流式细胞仪检测细胞凋亡结果：SIRT1沉默组、空载体组、空白对照组HCT116/ 5-FU细胞的细胞凋亡率分别为60% ± 5%、36%±4%、35%±4%，3组比较，差异有统计学意义（F ＝36.549，P <0.05）；SIRT1沉默组的细胞凋亡率显著高于空白对照组和空载体组，两组比较，差异有统计学意义（t＝－7.215，－7.084，P<0.05）。 （4）RT-PCR检测结果显示：SIRT1沉默组、空载体组和空白对照组HCT116/ 5-FU细胞中P-gp mRNA的相对表达量分别为0.320±0.030、0.990±0.060、1.000 ±0.090，3组比较，差异有统计学意义（F＝10.107，P<0.05）。SIRT1沉默组P-gp mRNA的相对表达量显著低于空白对照组，两组比较，差异有统计学意义（t＝11.463，P<0.05）。SP600125组、DMSO组以及对照组HCT116/ 5-FU细胞中P-gp mRNA的相对表达量分别为0.240 ±0.040、0.990 ± 0.100、1.000 ± 0.070，3组比较，差异有统计学意义（F ＝19.002，P<0.05）；SP600125组P-gp mRNA的相对表达量显著低于对照组，两组比较，差异有统计学意义（t＝7.301，P <0.05）。 （5）Western blot检测结果显示：空白对照组、空载体组、SIRT1沉默组HCT116/ 5-FU细胞中p-JNK蛋白的相对表达量分别为1.000 ±0.090、1.090 ±0.020、0.080 ±0.010, 3组比较，差异有统计学意义（F＝12.130，P<0.05）。5-FU干预HCT116细胞中各磷酸化位点蛋白水平与SIRT1总磷酸化蛋白水平比值p-SIRT1-S27/ T-SIRT1、p-SIRT1-T530/ T-SIRT1、p-SIRT1-S47/ T-SIRT1分别为1.158 ± 0.140、1.209 ± 0.150、3.760 ±0.150; DMSO干预HCT116细胞分别为1.120 ±0.109、1.130 ±0.100、2.160 ±0.110, 2种处理下细胞3个位点比较，差异均有统计学意义（F＝9.763, 10.261，P<0.05）。HCT116细胞5-FU和DMSO干预p-SIRT1-S47/ T-SIRT1均高于HCT116/ 5-FU细胞对应的0.940 ±0.040和1.121 ±0.110，两者比较，差异有统计学意义（t＝14.721, 21.335，P<0.05）。 （6) S47野生型组、阴性对照组以及突变体S47A组和S47D组细胞增殖率分别为41% ± 31%、39% ± 4%、64% ± 2％和26% ± 5%，4组比较，差异有统计学意义（F＝6.371，P<0.05）。
结论SIRT1促进结肠癌耐药细胞的增殖，并通过JNK信号通路上调P-gp的表达，从而增强结肠癌耐药性。SIRT1 S47位点为HCT116/ 5-FU细胞耐药的关键性位点。