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[摘要]自从1996年提出的HAART（高效抗逆转录病毒治疗）一方面显著降低了艾滋病的死亡率和发病率，提高了艾滋病患者的生存质量，延长了艾滋病患者的生命，并且降低了传染性，但是另一方面HIV-I具有高度的变异性和抗病毒药物的选择性压力，且部分艾滋病病人的依从性差，导致HIV病毒产生耐药突变。此次将滁州市2013年滁州市在治疗大于一年的艾滋病病人的耐药结果和亚型进行分析，为艾滋病病人的治疗做出疗效评估和监测。
[关键词]滁州市；艾滋病；耐药
[中图分类号]R51 2.91
[文献标识码]A
[文章编号]1672-501 8（201 7）01-256-01
1.材料与方法
1.1样品：采集滁州市2012年12月31日前所有在治疗艾滋病病人血浆共174份进行病毒载量检测，选取病毒载量检测值>1000CPS/ml的12位病人血浆继续进行HIV-1耐药基因型检测。
1.2 RNA提取提取试剂采用法国梅里埃NucliSENS miniMAG（1.0）核酸提取试剂手工提取。将200ml病人血浆样本加到裂解液管后充分混匀，并将试管在室温中静置裂解孵育10分钟以上，将二氧化硅和内标的混合液100ul加入裂解液中静置孵育10分钟以上，严格按照操作说明书进行手工清洗，最后用洗脱缓冲液把吸附的核酸洗脱下来。洗脱下来的核酸及时转移到无DNase和RNase的样品保存管中。
13NASBA反应加入引物在65度1分钟，41度1分钟预扩增，加酶在41度等温扩增1个小时。
1.4巢式聚合酶联链式反应使用反扩转录巢式PCR扩增HIV-1POL基因区片段。RNA逆转录和巢式第一轮PCR反应体系使用的是Takara公司的一步法试剂盒AMV（Takara one step RNA PCRkit）试剂盒.第二轮扩增使用TIANGEN2×Taq PCR Master Mix试剂对第一轮的扩增产物进行第二轮PCR。两轮扩增产物目的片段约为1200bp.
1.5RT-PCR反转录扩增反应和第二轮扩增反应第一轮扩增：引物MAW26、HBX2、RT21、HBX2各0.5ul，酶lul，bufferl2.5ul，无酶水5.5ul，RNA模板5ul，终体积为25ul。第二轮扩增：引物PRO-1、HBX2、RT20各lul，MIX25ul，无酶水18ul，RNA模板5ul，终体积为50度。
1.6电泳二轮PcR后的扩增产物用EB作核酸染料跑1%琼脂糖凝胶电泳。
1.7测序PCR产物送由博迈德公司纯化和测序。
1.8把所得到的fasta格式的程序文件提交斯坦福大学HIV耐药数据库（sHDB）得到耐药结果。
2.结果
2.1此次收集标本均为2012年12月31日前所以在治疗艾滋病病人血浆共174份。
其中病毒载量检测检测值>1000的共12人。并对12人进行耐药检测.其中异性传播10例，同性传播2例，男性8人，女性4人。
2.2亚型结果分析在POL区的亚型结果分析中，12例标本中有CRF01-AE重组亚型8例为最多，占66.7%（8/12），且两例同性传播亚型均为CRF01-AE重组亚型，其余四例均为B亚型。
2.3耐药基因情况分析
在12名抗病毒治疗的病人标本中有7例24个突变位点，没有出现蛋白酶抑制剂主要耐药相关突变，其中5例出现NRTIs和NNRTIs双突变。其中M184V和K103N位点突变次数最多，分别为4例。K65R位点突变频率为2次。见表1.
3.讨论
随着高效抗逆转录病毒治疗在我国广泛应用，以及不断增长的HIV-1感染者人数。单一或者多重艾滋病病毒耐药株也随之产生并传播。同时随着耐药株越来越多的出现，导致耐药株的流行，以至于原发性耐药感染者初次接受抗病毒治疗后可能失败或者无法持续控制HIV-1病毒复制。截止2012年12底我市在治疗病人共个，有12名病人病毒载量检测值>1000cps/ml，且只有7人出现不同程度耐药突变，但是都没有H主要突变和次要突变，说明目前使用的一线药物对我市绝大部分HIV-1病人有效。在这12个病人的治疗方案全部使用3TC，所以针对3TC的M184V位点频率最高，引起3TC、FFC的高度耐药同时引起ABC的潜在耐药。在一些调查研究中表明，K103N是所有NNRTIS治疗的所有病人里最普遍和重要的突变，可能会对所有的非核苷类反转录酶抑制剂产生20到50贝的耐药性。我市的12名病人突变次数最多K103N，和研究结果一致。12名病人中，治疗时间最长的病人只出现V106R突变，没有产生耐药，而出现多重药物重度耐药的病人治疗时间才两年。随访表明病人的服药依从性差。在我市病人中，外出务工病人占了一部分，回来不便等各种原因导致服药依从性差，还有长期使用同一种治疗方案都有可能导致耐药相关突变。要尽量可能提高这部分人群的服药依从性，否则即使使用二线药，也有可能产生耐药或者治疗失败。且现在我市新发病人中MSM成了主力军，据研究报道我国的男男新发感染人群里的原发性耐药率竟然高达14.4%，所以有必要對此人群进行治疗前耐药检测。在我实验室，耐药检测工作还未能开展，为了指导临床用药，为了艾滋病防控提供技术支持。
[关键词]滁州市；艾滋病；耐药
[中图分类号]R51 2.91
[文献标识码]A
[文章编号]1672-501 8（201 7）01-256-01
1.材料与方法
1.1样品：采集滁州市2012年12月31日前所有在治疗艾滋病病人血浆共174份进行病毒载量检测，选取病毒载量检测值>1000CPS/ml的12位病人血浆继续进行HIV-1耐药基因型检测。
1.2 RNA提取提取试剂采用法国梅里埃NucliSENS miniMAG（1.0）核酸提取试剂手工提取。将200ml病人血浆样本加到裂解液管后充分混匀，并将试管在室温中静置裂解孵育10分钟以上，将二氧化硅和内标的混合液100ul加入裂解液中静置孵育10分钟以上，严格按照操作说明书进行手工清洗，最后用洗脱缓冲液把吸附的核酸洗脱下来。洗脱下来的核酸及时转移到无DNase和RNase的样品保存管中。
13NASBA反应加入引物在65度1分钟，41度1分钟预扩增，加酶在41度等温扩增1个小时。
1.4巢式聚合酶联链式反应使用反扩转录巢式PCR扩增HIV-1POL基因区片段。RNA逆转录和巢式第一轮PCR反应体系使用的是Takara公司的一步法试剂盒AMV（Takara one step RNA PCRkit）试剂盒.第二轮扩增使用TIANGEN2×Taq PCR Master Mix试剂对第一轮的扩增产物进行第二轮PCR。两轮扩增产物目的片段约为1200bp.
1.5RT-PCR反转录扩增反应和第二轮扩增反应第一轮扩增：引物MAW26、HBX2、RT21、HBX2各0.5ul，酶lul，bufferl2.5ul，无酶水5.5ul，RNA模板5ul，终体积为25ul。第二轮扩增：引物PRO-1、HBX2、RT20各lul，MIX25ul，无酶水18ul，RNA模板5ul，终体积为50度。
1.6电泳二轮PcR后的扩增产物用EB作核酸染料跑1%琼脂糖凝胶电泳。
1.7测序PCR产物送由博迈德公司纯化和测序。
1.8把所得到的fasta格式的程序文件提交斯坦福大学HIV耐药数据库（sHDB）得到耐药结果。
2.结果
2.1此次收集标本均为2012年12月31日前所以在治疗艾滋病病人血浆共174份。
其中病毒载量检测检测值>1000的共12人。并对12人进行耐药检测.其中异性传播10例，同性传播2例，男性8人，女性4人。
2.2亚型结果分析在POL区的亚型结果分析中，12例标本中有CRF01-AE重组亚型8例为最多，占66.7%（8/12），且两例同性传播亚型均为CRF01-AE重组亚型，其余四例均为B亚型。
2.3耐药基因情况分析
在12名抗病毒治疗的病人标本中有7例24个突变位点，没有出现蛋白酶抑制剂主要耐药相关突变，其中5例出现NRTIs和NNRTIs双突变。其中M184V和K103N位点突变次数最多，分别为4例。K65R位点突变频率为2次。见表1.
3.讨论
随着高效抗逆转录病毒治疗在我国广泛应用，以及不断增长的HIV-1感染者人数。单一或者多重艾滋病病毒耐药株也随之产生并传播。同时随着耐药株越来越多的出现，导致耐药株的流行，以至于原发性耐药感染者初次接受抗病毒治疗后可能失败或者无法持续控制HIV-1病毒复制。截止2012年12底我市在治疗病人共个，有12名病人病毒载量检测值>1000cps/ml，且只有7人出现不同程度耐药突变，但是都没有H主要突变和次要突变，说明目前使用的一线药物对我市绝大部分HIV-1病人有效。在这12个病人的治疗方案全部使用3TC，所以针对3TC的M184V位点频率最高，引起3TC、FFC的高度耐药同时引起ABC的潜在耐药。在一些调查研究中表明，K103N是所有NNRTIS治疗的所有病人里最普遍和重要的突变，可能会对所有的非核苷类反转录酶抑制剂产生20到50贝的耐药性。我市的12名病人突变次数最多K103N，和研究结果一致。12名病人中，治疗时间最长的病人只出现V106R突变，没有产生耐药，而出现多重药物重度耐药的病人治疗时间才两年。随访表明病人的服药依从性差。在我市病人中，外出务工病人占了一部分，回来不便等各种原因导致服药依从性差，还有长期使用同一种治疗方案都有可能导致耐药相关突变。要尽量可能提高这部分人群的服药依从性，否则即使使用二线药，也有可能产生耐药或者治疗失败。且现在我市新发病人中MSM成了主力军，据研究报道我国的男男新发感染人群里的原发性耐药率竟然高达14.4%，所以有必要對此人群进行治疗前耐药检测。在我实验室，耐药检测工作还未能开展，为了指导临床用药，为了艾滋病防控提供技术支持。