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摘要 采用国标法、国标改进法及固相吸附法3种不同的前处理方式提取净化咖啡中的六六六、滴滴涕，建立了一种新型的高效、快速、灵敏度高的测定分析方法。结果表明，经过固相吸附法处理纯化提取的六六六、滴滴涕加标回收率最高，达到112.7%，结果稳定，重复准确率高。因此，与国标法相比较，固相吸附法更适宜用于咖啡中六六六、滴滴涕的检测。
关键词 小粒咖啡；六六六；滴滴涕；残留量；测定方法；云南省
中图分类号 S571.204；TS207.53 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）20-0094-02
随着人们生活水平质量的提高，国内咖啡的需求量直线上升。目前，云南省已成为中国最大的咖啡生产基地，种植面积和产量都已占到全国的98%以上。但是，在咖啡的种植过程中由于受到各种病虫害的传播，并且在其生产加工中有可能受到污染。因此，咖啡饮品的质量安全问题备受人们的关注。
目前，六六六、滴滴涕等有机氯类农药广泛用于咖啡的栽培管理中，其杀虫效果显著，但其毒性大，不易分解，并且长期存在于土壤及植物体内，不仅严重污染环境，也导致了食品安全隐患问题。但由于咖啡的基质复杂[1-2]，颗粒较细，油脂及色素含量较高，给咖啡中的农药残留测定造成困难，国内外关于咖啡中农药残留的研究报道也非常有限[3]。
本研究分别采用国标法、国标改进法及固相吸附法3种方法萃取纯化小粒咖啡中的六六六、滴滴涕，利用气象色谱检测器进行分析，并通过比较加标回收率以便确认可准确用于测定咖啡中2种农药残留量的最适宜的方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
气相色谱仪（安捷伦；Agilent 7890A）；分析天平（岛津；AUY220）；旋转蒸发仪（东悦；R301）、石油醚（阿拉丁；色谱纯）、浓硫酸（阿拉丁）、氯化钠（阿拉丁；色谱纯）、柠檬酸钠（阿拉丁；色谱纯）、无水硫酸镁（阿拉丁；色谱纯）、甲苯（阿拉丁；色谱纯）、柠檬酸氢二钠（阿拉丁；色谱纯）、N-丙基乙二胺键合固相吸附剂（Agela；PA0100）、乙腈（阿拉丁；色谱纯）。
六六六、滴滴涕标准品：a-六六六、γ-六六六、？奁-六六六的浓度为0.005 mg/L；PP’-DDT浓度为0.1 mg/L；P P’-DDD：0.02 mg/L；OP’-DDT浓度为0.05 mg/L；β-六六六和PP’-DDE浓度为0.01 mg/L。以上标准品均购于阿拉丁试剂，分析标准品。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的配制。精密称取标准品各10 mg，溶于苯中，分别移于100 mL容量瓶中，以苯稀释至刻度，混匀，浓度为100 mg/L，贮于4 ℃冰箱中。
农药混合标准工作液：分别量取上述各标准液于同一容量瓶中，以正己烷稀释至刻度。a-六六六、γ-六六六、？奁-六六六的浓度为0.005 mg/L；P P′-DDD浓度为0.02 mg/L；OP′-DDT浓度为0.05 mg/L；PP′-DDT浓度为0.1 mg/L；β-六六六和PP′-DDE浓度为0.01 mg/L。
1.2.2 色谱条件。色谱柱为长2 m、内径3 mm的玻璃柱，内装涂以2% QF-1和1.5% OV-17混合固定液的0.149～0.177 mm硅藻土。检测器温度225 ℃；进样口温度195 ℃；柱温185 ℃。载气为高纯氮，流速110 mL/min；进样量为1～10 uL。外标法定量。
1.2.3 样品前处理及测定。本试验采用浓度为1.25 mg/kg六六六、滴滴涕的农药对云南小粒咖啡粉进行处理，采用3种不同的方法提取净化六六六、滴滴涕进行气相色谱法测定其含量。
国标法：根据国家检测标准GB/T 5009.19-2008采用的方法对样品进行提取纯化，具体如下：
（1）称取1 g咖啡粉，用37 μm（相当于400目）筛选，加入1 mL混合内标工作液进行处理。
（2）加入石油醚20 mL，震荡30 min（150 r/min），然后过滤，旋转蒸发仪蒸发至近干（温度设置为65～70 ℃），定容至5 mL。
（3）加0.5 mL浓硫酸净化，振摇0.5 min，于3 000 r/min离心15 min。取上清液进行测定。
国标改进法：
（1）称取1 g咖啡粉，用37 μm（相当于400目）筛选，加入1 mL混合内标工作液进行处理。
（2）加石油醚∶丙酮（5∶1，v/v）20 mL，震荡30 min（150 r/min），过滤，旋转蒸发仪蒸发至近干（温度设置为65～70 ℃），定容至5 mL。
（3）加0.5 mL浓硫酸净化，振摇0.5 min，于3 000 r/min离心15 min。取上清液进行测定。
固相吸附法：
（1）称取咖啡粉1 g（精确至0.1 mg）置于50 mL具盖离心管中，加入10 mL水，振荡，直至样品被水充分浸润，静止10 min。
（2）移取乙腈10 mL和混合内标工作液1 mL到离心管中，于漩涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡1 min，分别加入无水硫酸镁4 g、氯化钠1 g、柠檬酸钠1 g、柠檬酸氢二钠0.5 g和甲苯5 mL，立即于漩涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡2 min，然后以4 000 r/min 离心10 min。
（3）移取5 mL样品提取液上层清液于10 mL离心管中，加入无水硫酸镁500 mg和N-丙基乙二胺键合固相吸附剂150 mg，于漩涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡2 min，以6 000 r/min 离心2 min，上机测定。
1.2.4 加标回收率的测定。称取小粒咖啡生豆样品1.0 g，加入已知浓度的标准品混合液1 mL，得到回收率测试样本，与样品同方法进行处理，取1 μL上清液进行分析。 1.2.5 结果计算。试样中六六六、滴滴涕及其异构体或代谢物的单一物质的质量分数计算公式如下：
W=（A1/A2）×m1/m2×V1/V2
式中，W为试样中六六六、滴滴涕及其异构体或代谢物的单一物质的质量分数（mg/kg）；m1为单一农药标准溶液的质量（ng）；m2为被测定试样的取样量（g）；A2为各农药组分标准的峰值；A1为被测定试样各组分的峰值（峰高或面积）；V1为被测定试样的稀释体积（mL）；V2为被测定试样的进样体积（uL）。
2 结果与分析
六六六、滴滴涕经提取、净化后用气相色谱法测定，与标准比较定量。六六六的4种异构体标准品的出峰顺序为α-六六六、β-六六六、γ-六六六和δ-六六六；滴滴涕的4种异构体标准品的出峰顺序为PP’-DDE、OP’-DDT、PP’-DDT和PP’-DDD。加标处理后样品中六六六、滴滴涕农药残留量测定的结果如图1所示。
小粒咖啡经同一浓度（1.25 mg/kg）混合标准品处理后，2种农药残留量的测定结果差距较大。利用国标法测定的结果准确率较低，其次为国标改进法，固相萃取测定的方法准确率最高。回收率测试结果见表1，可以看出，3 种处理方法的平均回收率在79.8%～112.7%之间。由此可见，固相萃取纯化回收得到的六六六、滴滴涕的残留量最高，测量准确，可以减少萃取操作中的损失。
3 结论与讨论
咖啡作为一种深受人们喜爱的饮品，对其需求量日益增加。据有关数据统计，我国咖啡消费者的数量越来越大，通过对咖啡农药残留进行检测，既可以保障消费者的身体健康，也可以限制国外一些农残超标的咖啡进入我国市场。咖啡中的农药残留主要是由于种植过程中使用或环境中摄入的，常用的杀虫剂及杀菌剂有六六六、滴滴涕、乐果、百菌清、多菌灵、甲基托布津等[4]。这些农药的种类繁多，性质各异，传统的分析方法难以保证其检测精度。
目前，利用离子-气象色谱-质谱联用的方法成为研究的热点[5]，但是测定费用较高并且针对性较差。随着现代检测技术的进步，开发高效准确的农药残留检测方法，以及严格的农药限量标准尤其重要[6-9]。
本研究中采用3种不同的方法萃取净化咖啡粉中六六六、滴滴涕，并通过气相色谱检测技术对其残留量进行了测定。经过分析发现：国标法中液-液分配萃取纯化材料用量大，需经多次纯化才能得到合格净化液，耗时长，操作麻烦，回收率低，六六六和滴滴涕的测定结果不稳定；改进的国标处理方法，六六六和滴滴涕不同异构体的结果差异很大；固相吸附法采用N-丙基乙二胺键合固相吸附剂净化效果好，回收率高，材料节省并且没有采用有毒物质，测定方法准确，精密度较高。因此，固相吸附法可作为测定六六六和滴滴涕的主要方法，比传统检测法更能满足目前的要求。
4 参考文献
[1] 周瑞泽，佟玲，李重九，等.气相色谱-负离子化学电离质谱法对咖啡中8种有机氯农药的检测[J].分析测试学报，2008（27）：157-160.
[2] 钱宗耀，马磊，安冉，等.气相色谱-质谱联用法检测咖啡中49种农药残留量[J].江苏农业科学，2013，41（7）：287-289.
[3] 陈祎平，林邵华，梁振益，等.咖啡渣油脂的提取及脂肪酸组成研究[J].食品科技，2005（12）：84-86.
[4] 李维锐，张洪波，李文伟.小粒种咖啡病虫害防治技术规程（NY/T1698-2009）[S].北京：中国标准出版社，2009.
[5] 邱建伟.茶叶和咖啡中农药多残留的检测方法研究[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2007.
[6] 王玉健，黄惠玲，禗开智，等.超高效液相色谱-串联质谱测定多种食品中抑霉唑、嘧霉胺、克百威、三唑磷、多菌灵的残留量[J].分析试验室，2011，30（5）：77-80.
[7] 罗小玲，刘长勇.高效液相色谱法测定果蔬饮料中的克百威和甲萘威农药残留[J].食品科学，2009（8）：245-246.
[8] 刘春华，乐渊，阳辛风，等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定生咖啡豆中多菌灵等农药残留[J].广东农业科学，2012，39（24）：108-110.
[9] 史晓梅，陈士恒，章晴，等.分散固相萃取—气相色谱法测定大米中六六六和滴滴涕残留量[J].食品安全质量检测学报，2014（4）：1117-1124.
关键词 小粒咖啡；六六六；滴滴涕；残留量；测定方法；云南省
中图分类号 S571.204；TS207.53 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）20-0094-02
随着人们生活水平质量的提高，国内咖啡的需求量直线上升。目前，云南省已成为中国最大的咖啡生产基地，种植面积和产量都已占到全国的98%以上。但是，在咖啡的种植过程中由于受到各种病虫害的传播，并且在其生产加工中有可能受到污染。因此，咖啡饮品的质量安全问题备受人们的关注。
目前，六六六、滴滴涕等有机氯类农药广泛用于咖啡的栽培管理中，其杀虫效果显著，但其毒性大，不易分解，并且长期存在于土壤及植物体内，不仅严重污染环境，也导致了食品安全隐患问题。但由于咖啡的基质复杂[1-2]，颗粒较细，油脂及色素含量较高，给咖啡中的农药残留测定造成困难，国内外关于咖啡中农药残留的研究报道也非常有限[3]。
本研究分别采用国标法、国标改进法及固相吸附法3种方法萃取纯化小粒咖啡中的六六六、滴滴涕，利用气象色谱检测器进行分析，并通过比较加标回收率以便确认可准确用于测定咖啡中2种农药残留量的最适宜的方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
气相色谱仪（安捷伦；Agilent 7890A）；分析天平（岛津；AUY220）；旋转蒸发仪（东悦；R301）、石油醚（阿拉丁；色谱纯）、浓硫酸（阿拉丁）、氯化钠（阿拉丁；色谱纯）、柠檬酸钠（阿拉丁；色谱纯）、无水硫酸镁（阿拉丁；色谱纯）、甲苯（阿拉丁；色谱纯）、柠檬酸氢二钠（阿拉丁；色谱纯）、N-丙基乙二胺键合固相吸附剂（Agela；PA0100）、乙腈（阿拉丁；色谱纯）。
六六六、滴滴涕标准品：a-六六六、γ-六六六、？奁-六六六的浓度为0.005 mg/L；PP’-DDT浓度为0.1 mg/L；P P’-DDD：0.02 mg/L；OP’-DDT浓度为0.05 mg/L；β-六六六和PP’-DDE浓度为0.01 mg/L。以上标准品均购于阿拉丁试剂，分析标准品。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的配制。精密称取标准品各10 mg，溶于苯中，分别移于100 mL容量瓶中，以苯稀释至刻度，混匀，浓度为100 mg/L，贮于4 ℃冰箱中。
农药混合标准工作液：分别量取上述各标准液于同一容量瓶中，以正己烷稀释至刻度。a-六六六、γ-六六六、？奁-六六六的浓度为0.005 mg/L；P P′-DDD浓度为0.02 mg/L；OP′-DDT浓度为0.05 mg/L；PP′-DDT浓度为0.1 mg/L；β-六六六和PP′-DDE浓度为0.01 mg/L。
1.2.2 色谱条件。色谱柱为长2 m、内径3 mm的玻璃柱，内装涂以2% QF-1和1.5% OV-17混合固定液的0.149～0.177 mm硅藻土。检测器温度225 ℃；进样口温度195 ℃；柱温185 ℃。载气为高纯氮，流速110 mL/min；进样量为1～10 uL。外标法定量。
1.2.3 样品前处理及测定。本试验采用浓度为1.25 mg/kg六六六、滴滴涕的农药对云南小粒咖啡粉进行处理，采用3种不同的方法提取净化六六六、滴滴涕进行气相色谱法测定其含量。
国标法：根据国家检测标准GB/T 5009.19-2008采用的方法对样品进行提取纯化，具体如下：
（1）称取1 g咖啡粉，用37 μm（相当于400目）筛选，加入1 mL混合内标工作液进行处理。
（2）加入石油醚20 mL，震荡30 min（150 r/min），然后过滤，旋转蒸发仪蒸发至近干（温度设置为65～70 ℃），定容至5 mL。
（3）加0.5 mL浓硫酸净化，振摇0.5 min，于3 000 r/min离心15 min。取上清液进行测定。
国标改进法：
（1）称取1 g咖啡粉，用37 μm（相当于400目）筛选，加入1 mL混合内标工作液进行处理。
（2）加石油醚∶丙酮（5∶1，v/v）20 mL，震荡30 min（150 r/min），过滤，旋转蒸发仪蒸发至近干（温度设置为65～70 ℃），定容至5 mL。
（3）加0.5 mL浓硫酸净化，振摇0.5 min，于3 000 r/min离心15 min。取上清液进行测定。
固相吸附法：
（1）称取咖啡粉1 g（精确至0.1 mg）置于50 mL具盖离心管中，加入10 mL水，振荡，直至样品被水充分浸润，静止10 min。
（2）移取乙腈10 mL和混合内标工作液1 mL到离心管中，于漩涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡1 min，分别加入无水硫酸镁4 g、氯化钠1 g、柠檬酸钠1 g、柠檬酸氢二钠0.5 g和甲苯5 mL，立即于漩涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡2 min，然后以4 000 r/min 离心10 min。
（3）移取5 mL样品提取液上层清液于10 mL离心管中，加入无水硫酸镁500 mg和N-丙基乙二胺键合固相吸附剂150 mg，于漩涡混合振荡仪上以2 000 r/min 速度振荡2 min，以6 000 r/min 离心2 min，上机测定。
1.2.4 加标回收率的测定。称取小粒咖啡生豆样品1.0 g，加入已知浓度的标准品混合液1 mL，得到回收率测试样本，与样品同方法进行处理，取1 μL上清液进行分析。 1.2.5 结果计算。试样中六六六、滴滴涕及其异构体或代谢物的单一物质的质量分数计算公式如下：
W=（A1/A2）×m1/m2×V1/V2
式中，W为试样中六六六、滴滴涕及其异构体或代谢物的单一物质的质量分数（mg/kg）；m1为单一农药标准溶液的质量（ng）；m2为被测定试样的取样量（g）；A2为各农药组分标准的峰值；A1为被测定试样各组分的峰值（峰高或面积）；V1为被测定试样的稀释体积（mL）；V2为被测定试样的进样体积（uL）。
2 结果与分析
六六六、滴滴涕经提取、净化后用气相色谱法测定，与标准比较定量。六六六的4种异构体标准品的出峰顺序为α-六六六、β-六六六、γ-六六六和δ-六六六；滴滴涕的4种异构体标准品的出峰顺序为PP’-DDE、OP’-DDT、PP’-DDT和PP’-DDD。加标处理后样品中六六六、滴滴涕农药残留量测定的结果如图1所示。
小粒咖啡经同一浓度（1.25 mg/kg）混合标准品处理后，2种农药残留量的测定结果差距较大。利用国标法测定的结果准确率较低，其次为国标改进法，固相萃取测定的方法准确率最高。回收率测试结果见表1，可以看出，3 种处理方法的平均回收率在79.8%～112.7%之间。由此可见，固相萃取纯化回收得到的六六六、滴滴涕的残留量最高，测量准确，可以减少萃取操作中的损失。
3 结论与讨论
咖啡作为一种深受人们喜爱的饮品，对其需求量日益增加。据有关数据统计，我国咖啡消费者的数量越来越大，通过对咖啡农药残留进行检测，既可以保障消费者的身体健康，也可以限制国外一些农残超标的咖啡进入我国市场。咖啡中的农药残留主要是由于种植过程中使用或环境中摄入的，常用的杀虫剂及杀菌剂有六六六、滴滴涕、乐果、百菌清、多菌灵、甲基托布津等[4]。这些农药的种类繁多，性质各异，传统的分析方法难以保证其检测精度。
目前，利用离子-气象色谱-质谱联用的方法成为研究的热点[5]，但是测定费用较高并且针对性较差。随着现代检测技术的进步，开发高效准确的农药残留检测方法，以及严格的农药限量标准尤其重要[6-9]。
本研究中采用3种不同的方法萃取净化咖啡粉中六六六、滴滴涕，并通过气相色谱检测技术对其残留量进行了测定。经过分析发现：国标法中液-液分配萃取纯化材料用量大，需经多次纯化才能得到合格净化液，耗时长，操作麻烦，回收率低，六六六和滴滴涕的测定结果不稳定；改进的国标处理方法，六六六和滴滴涕不同异构体的结果差异很大；固相吸附法采用N-丙基乙二胺键合固相吸附剂净化效果好，回收率高，材料节省并且没有采用有毒物质，测定方法准确，精密度较高。因此，固相吸附法可作为测定六六六和滴滴涕的主要方法，比传统检测法更能满足目前的要求。
4 参考文献
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[8] 刘春华，乐渊，阳辛风，等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定生咖啡豆中多菌灵等农药残留[J].广东农业科学，2012，39（24）：108-110.
[9] 史晓梅，陈士恒，章晴，等.分散固相萃取—气相色谱法测定大米中六六六和滴滴涕残留量[J].食品安全质量检测学报，2014（4）：1117-1124.