【摘 要】
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目的:通过体外细胞学实验研究嘧啶核苷酸从头合成的关键酶氨基甲酰磷酸合成酶2-天冬氨酸转氨甲酰酶-二氢乳清酶(CAD)三功能酶对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用,并初步探讨其潜在机制.方法:利用生物信息学方法分析癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达数据库(GEO)中食管癌数据集的肿瘤组织与癌旁正常组织中CAD的表达高低.在食管癌细胞中敲减或过表达CAD,用Western blot验证敲减或过表达效率.利用活细胞动态成像与分析系统(IncuCyte)和集落形成实验检测细胞的生长和增殖能力,Transwell实
【机 构】
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中山大学附属第六医院广东省结直肠盆底疾病研究重点实验室,广东省胃肠病学研究所,广东广州510655
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目的:通过体外细胞学实验研究嘧啶核苷酸从头合成的关键酶氨基甲酰磷酸合成酶2-天冬氨酸转氨甲酰酶-二氢乳清酶(CAD)三功能酶对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用,并初步探讨其潜在机制.方法:利用生物信息学方法分析癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达数据库(GEO)中食管癌数据集的肿瘤组织与癌旁正常组织中CAD的表达高低.在食管癌细胞中敲减或过表达CAD,用Western blot验证敲减或过表达效率.利用活细胞动态成像与分析系统(IncuCyte)和集落形成实验检测细胞的生长和增殖能力,Transwell实验检测迁移和侵袭能力.通过基因集富集分析(GSEA)获得TCGA食管癌组织中富集在CAD高表达组的信号通路.利用基因表达谱交互分析(GEPIA)网站对CAD与潜在下游基因MYC的mRNA表达相关性进行分析(Pearson法),应用RT-qPCR方法检测CAD调控的下游通路基因的mRNA水平,通过Western blot检测MYC和上皮-间充质转化(EMT)通路相关蛋白的表达.在食管癌细胞中敲减CAD,同时过表达MYC,观察细胞的生长和增殖能力是否改变.结果:(1)TCGA和GEO食管癌数据集显示肿瘤组织的CAD表达水平显著高于癌旁正常组织.(2)敲减CAD表达后,食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到显著抑制.(3)过表达CAD能够促进食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力.(4)基因富集分析显示,β-catenin、MYC和糖酵解通路富集在CAD高表达组.(5)Pearson关联分析显示,CAD与MYC的mRNA水平呈正相关(r=0.43,P<0.001);Western blot结果显示,敲减CAD能够降低β-catenin、MYC及EMT相关蛋白的表达水平;RT-qPCR结果显示,敲减CAD后,己糖激酶2(HK2)、血小板型磷酸果糖激酶(PFKP)、磷酸甘油酸酯激酶1(PGK1)、烯醇化酶1(ENO1)、丙酮酸激酶肌肉同工酶2(PKM2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)及葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)等一系列糖酵解相关基因的表达水平都受到了抑制.(6)敲减CAD抑制食管癌细胞的增殖能力,而过表达MYC后细胞的增殖能力得到部分恢复.结论:体外细胞实验表明,CAD可能通过调控β-catenin/MYC/糖酵解及EMT信号通路而增强食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力.
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