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摘要：通过乙酸乙酯振荡提取和HPLC-PAD测定方法，获得胡桃醌在土壤样品中的残留量。结果表明：当添加质量分数为1.0、10.0 mg/kg时，胡桃醌在黄壤、水稻土、石灰土中的添加平均回收率分别为85.5%～86.6%、76.0%～89.1%、78.1%～84.6%，相对标准偏差（RSD）分别为6.3%～8.2%、2.0%～5.9%、2.5%～3.4%；胡桃醌的最低检出量为5.0 ng，在土壤中的最低检出浓度为1.0 mg/kg。该方法操作简单，准确度、精密度及灵敏度均满足农药残留分析的要求，可用于土壤中胡桃醌残留量的检测。
关键词：胡桃醌；土壤；残留分析；高效液相色谱
中图分类号： O657.7 2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0294-03
收稿日期：2014-04-25
基金项目：国际合作项目（编号：2011DFB41640）；贵州科学院青年基金项目（编号：黔科院J合字[2011]25号、黔科院J合字[2014]14号）；贵州科学院青年基金项目（编号：黔科院J合字[2013]11号）。
作者简介：赵亚洲（1989—），男，陕西渭南人，硕士研究生，研究方向为环境毒理。E-mail：zhao-yazhou-1234@163.com。
通信作者：谭红，研究员，主要从事食品安全、环境监测、新化学物质毒理测试研究。E-mail：tan-hong@tom.com。胡桃醌（juglone）别称5-羟基-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘二酮，主要存在于胡桃科核桃属植物胡桃楸（Juglans Mandshurica Maxim.）和核桃（Juglans regia）的根皮、树皮、青龙衣中，是胡桃属中分离出来的小分子萘醌[1]。Hejl等通过水溶液培养液毒性测试试验，证明了胡桃醌对某些植物有潜在的毒理作用[2]；Inbaraj等发现在胡桃醌培养液中胡桃醌表现出抗病毒、抗细菌、抗真菌的活性功效[3]。研究还发现，胡桃醌在医药行业、农药行业以及食品、日用品等方面有着广泛的应用价值[4]，并且其在环境中的行为特性研究也受到了人们的关注。
萘醌类化合物根据其结构特征分为α-（1，4）、β-（1，2）及amphi-（2，6）3种类型，至今从自然界得到的大都是α-萘醌类化合物[5]。宫玉涛等研究了萘醌类化合物中的2-羟基-1，4萘醌在土壤中的降解作用和淋溶行为，5 g土壤样品（2-羟基-1，4萘醌添加浓度为1、2、10、20 mg/kg）通过加入25 mL的去离子水，振荡萃取30 min后离心15 min，上清液直接用HPLC测定，该方法的回收率为70.24%～7712%[6]，尽管胡桃醌与2-羟基-1，4萘醌同属萘醌类化合物，但由于-OH基团的位置不同，使得它们的水溶性差别较大，因此在提取土壤中的胡桃醌时，不宜采用水作为提取溶剂。王文泽等用多种提取溶剂提取核桃楸青果皮中胡桃醌，发现以乙酸乙酯作为提取溶剂时提取率较高，达到0404%[7]。季宇彬等使用多种溶剂从青龙衣中提取胡桃醌，发现乙酸乙酯的提取率最好[8]。程力惠等用乙醇提取核桃球树皮中的胡桃醌，发现超声提取比冷浸法和回流法提取率高[9]。Yang等用氯仿对东北核桃种植园土壤、松叶林土壤以及核桃-松叶林植被间土壤中的胡桃醌进行提取，测得胡桃醌回收率分别为87.1%、85.4%、86.2%[10]。De Scisciolo等在提取不同季节胡桃树下土壤中胡桃醌含量时采用甲醇-冰乙酸作为提取溶剂，提取效果较好[11]。索绪斌等使用高效液相色谱法测定青龙衣中的胡桃醌含量，该方法灵敏度高、准确性与重现性好[12]。孙墨珑等使用分光光度法测定胡桃树皮中胡桃醌含量，方法简单、易操作[13]。孙墨珑等采用 GC-MS 联用法对胡桃树皮中胡桃醌进行测定，该方法灵敏度高、准确性好[14]。本研究在前人研究的基础上，建立了高效液相色谱法测定胡桃醌在土壤中的残留分析方法，本方法操作简单，准确度、精密度、灵敏度均满足农药残留分析的要求，可用于土壤中胡桃醌残留量的测定。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；RE-2000A旋转蒸发仪、YRDC-0506低温冷却循环泵、SHZ-Ⅲ循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；HY-8调速多用振荡箱（常州国华电器有限公司）；SG5200HDT超声波清洗仪（上海冠特超声仪器有限公司）；DT500A电子天平（常熟市意欧仪表有限公司）；移液枪（GILSON）；具塞三角瓶、茄形瓶、抽滤瓶、布氏漏斗以及其他常规实验室设备。
胡桃醌标准品（99%，国家农药产品质检中心），甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司），乙酸乙脂（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）。
1.2试验材料
本试验以黄壤、石灰土、水稻土作为供试土壤，其中黄壤采于贵州省清镇市中八茶园；水稻土采于贵州省平坝县稻田；石灰土采于贵州省关岭县花江旱地。土壤样品采集后，摊成2 cm厚的薄层，间断地压碎、翻拌，拣出碎石、砂砾及植物残体等杂质，置于室温自然晾干后，磨碎过2 mm筛，4 ℃冰箱保存备用。土壤的理化性质见表1。
1.3试验方法
1.3.1样品处理称取20.0 g 土壤（黄壤、水稻土、石灰土）于250 mL的具塞三角瓶中，加入120 mL乙酸乙酯于三角瓶中，置于振荡器中振荡（转速190 r/min）提取60 min，抽滤并用5 mL乙酸乙酯洗涤残渣，合并提取液，旋转至干后加 5 mL 甲醇充分溶解，过0.45 μm有机滤膜，HPLC定量分析。
1.3.2色谱条件色谱柱：Thermo scientific BETASIL-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流动相：甲醇 ∶水=4 ∶1（体积比）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测器：PAD；检测波长：250 nm；进样体积10 μL。 1.3.3标准曲线准确称取0.101 0 g（准确至0.1 mg）胡桃醌（纯度为99%）于称量瓶中，用甲醇少量多次溶解后，将其定量转入100 mL 容量瓶中，定容、摇匀后即得 1 000 mg/L 的胡桃醌储备液，冷藏备用。分别量取不同体积的母液，配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的标准溶液系列，以胡桃醌的质量浓度为横坐标（x）、响应的峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。
1.3.4准确度和精密度试验方法的准确度和精密度通过添加回收率和变异系数来表示[15]。3种土壤均分别加入质量分数为50.0、500.0 mg/L的胡桃醌标准溶液0.40 mL，使胡桃醌质量分数分别为1.0、10.0 mg/kg，每组设定5个平行，样品经处理后，用HPLC法测定3种土壤中的胡桃醌残留量。
1.3.5检出限和定量限方法的检出限为空白样品（待测目标物含量最低样品）多次平行测定（n>5）的标准偏差的3倍所对应的浓度。
2结果与分析
2.1提取溶剂的选择
本研究在前人试验的基础上比较了5种溶剂（甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇 ∶乙酸（11 ∶1，体积比）的提取回收率（表2），回收率试验结果表明，乙酸乙酯、三氯甲烷和乙腈的提取回收率较高，均能满足回收率试验要求，相比较而言，乙酸乙酯、三氯甲烷的回收率最好。考虑到三氯甲烷毒性较大，一般在实验室内应尽量少使用，因此选择土壤中胡桃醌的提取溶剂时，以乙酸乙酯为佳。
2.2标准曲线与线性范围
胡桃醌的峰面积和浓度具有良好线性相关性，线性方程y=35 288x 4 108.7，r=0.999 9，标准曲线见图1。2.0 mg/L 胡桃醌标准溶液的色谱图见图2，胡桃醌的保留时间约为4.2 min，最小检出量为5.0×10-9 g。
2.3仪器的精密度
待基线稳定后连续对同一浓度的标样（2.0 mg/L）进行6次平行测定，进样量为10 μL，其结果见表3。连续6次重复测定胡桃醌含量的变异系数为0.01%，保留时间变异系数为0.002%，说明该方法重现性好，仪器的精密度高。
2.4准确度和精密度结果
由表4可以看出，胡桃醌在黄壤、水稻土、石灰中的平均添加回收率分别为85.5%～86.6%、76.0%～89.1%、781%～84.6%，RSD分别为6.3%～8.2%、2.0%～5.9%、2.5%～3.4%，方法的准确度和精密度均满足农药残留分析的要求[16]，胡桃醌在土壤中的空白回收率色谱图、添加色谱图分别见图3、图4。
2.5方法的检出限和定量限
本方法中胡桃醌的最小检出量为5.0 ng，土壤中的最小检出浓度（LOQ）为1.0 mg/kg。
3结论
本研究结合了前人在提取核桃楸青果皮中胡桃醌时所选用的提取溶剂 通过试验最终选取如下方法测定土壤中胡桃表4胡桃醌在3种土壤中的平均添加回收率醌含量：以120 mL乙酸乙酯振荡提取60 min，抽滤并用5 mL乙酸乙酯洗涤残渣，合并提取液，旋转至干后加5 mL甲醇充分溶解，过0.45 μm有机滤膜，HPLC定量分析。当胡桃醌的添加质量分数为1.0、10.0 mg/kg，胡桃醌在黄壤、水稻土、石灰土中的添加平均回收率分别为85.5%～86.6%、76.0%～89.1%、78.1%～84.6%，RSD分别为6.3%～8.2%、2.0%～5.9%、2.5%～3.4%，最小检出量为5.0ng，土壤中最小检出浓度为1.0 mg/kg。本方法样品处理简单，准确度、精密度及灵敏度均满足农药残留分析的要求，可用于土壤中胡桃醌残留量的测定。
参考文献：
[1]曲中原，邹翔，胡国军，等. 青龙衣中胡桃醌提取工艺研究[J]. 中医药学报，2008，36（4）：30-32.
[2]Hejl A M，Koster K L.Juglone disrupts root plasma membrane H -ATPase activity and impairs water uptake，root respiration and growth in soybean（Glycine max）and corn（Zea mays）[J]. Chen Ecol，2004，30：453-471.
[3]Inbaraj J J，Chignell C F. Cytotoxic action of juglone and plumbagin：A mechanistic study using HaCaT keratinocytes[J]. Chemical Research in Toxicology，2004，17（1）：55-62.
[4]李聪，张明晓，陈雯. 胡桃醌的合成研究进展[J]. 精细化工中间体，2010，40（6）：11-15.
[5]刘红兵，崔承彬，任虹，等. 天然来源萘醌及其人工衍生物抗癌剂的研究进展[J]. 天然产物研究与开发，2005，17（1）：104-107.
[6]宫玉涛，宋文华，高敏苓，等. 2-羟基-1，4-萘醌在土壤中降解作用和淋溶行为研究[J]. 农业环境科学学报，2012，31（5）：957-961.
[7]王文泽，刘洪章，刘淑英，等. 核桃楸青果皮中胡桃醌的提取工艺研究[J]. 北方园艺，2013（15）：153-157.
[8]季宇彬，严琴琴，曲中原，等. 正交试验法优选青龙衣中胡桃醌的提取工艺[J]. 现代药物与临床，2009，24（3）：151-154.
[9]程力惠，黄晓文. 核桃楸树皮中胡桃醌提取方法及其工艺研究[J]. 亚热带植物科学，2010，39（4）：33-35.
[10]Yang L X，Wang P，Kong C H.Effect of larch （Larix gmelini Rupr.） root exudates on Manchurian walnut（Juglans mandshurica Maxim.）growth and soil juglone in a mixed-species plantation[J]. Plant Soil，2010，329：249-258.
[11]De Scisciolo B，Leopold D J，Walton D C.Seasonal patterns of juglone in soil beneath Juglans nigra （black walnut）and influence of J.nigra on understory vegetation[J]. Journal of Chemical Ecology，1990，16（4）：1111-1130.
[12]索绪斌，高奎滨，张云凌，等. 高效液相色谱法测定青龙衣中胡桃醌含量[J]. 中药材，2003，26（11）：793.
[13]孙墨珑，袁海舰，宋湛谦，等. 分光光度法测定核桃楸树皮中胡桃醌的含量[J]. 东北林业大学学报，2007，35（6）：37-38.
[14]孙墨珑，宋湛谦，方桂珍，等. 减压蒸馏法提取核桃楸树皮中的胡桃醌[J]. 林产化学与工业，2007，27（6）：113-115.
[15]刘光学，乔雄梧，陶传江，等，NY/T 788—2004农药残留试验准则[S]. 北京：中华人民共和国农业部，2004.
[16]岳永德，朱鲁生. 农药残留分析[M]. 北京：中国农业出版社，2004：36-80.董蒙蒙，喻樊，刘佳，等. 中华补血草5种黄酮类化合物抗氧化和抗肿瘤活性的比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：297-299.
关键词：胡桃醌；土壤；残留分析；高效液相色谱
中图分类号： O657.7 2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0294-03
收稿日期：2014-04-25
基金项目：国际合作项目（编号：2011DFB41640）；贵州科学院青年基金项目（编号：黔科院J合字[2011]25号、黔科院J合字[2014]14号）；贵州科学院青年基金项目（编号：黔科院J合字[2013]11号）。
作者简介：赵亚洲（1989—），男，陕西渭南人，硕士研究生，研究方向为环境毒理。E-mail：zhao-yazhou-1234@163.com。
通信作者：谭红，研究员，主要从事食品安全、环境监测、新化学物质毒理测试研究。E-mail：tan-hong@tom.com。胡桃醌（juglone）别称5-羟基-1，4-萘醌、5-羟基-1，4-萘二酮，主要存在于胡桃科核桃属植物胡桃楸（Juglans Mandshurica Maxim.）和核桃（Juglans regia）的根皮、树皮、青龙衣中，是胡桃属中分离出来的小分子萘醌[1]。Hejl等通过水溶液培养液毒性测试试验，证明了胡桃醌对某些植物有潜在的毒理作用[2]；Inbaraj等发现在胡桃醌培养液中胡桃醌表现出抗病毒、抗细菌、抗真菌的活性功效[3]。研究还发现，胡桃醌在医药行业、农药行业以及食品、日用品等方面有着广泛的应用价值[4]，并且其在环境中的行为特性研究也受到了人们的关注。
萘醌类化合物根据其结构特征分为α-（1，4）、β-（1，2）及amphi-（2，6）3种类型，至今从自然界得到的大都是α-萘醌类化合物[5]。宫玉涛等研究了萘醌类化合物中的2-羟基-1，4萘醌在土壤中的降解作用和淋溶行为，5 g土壤样品（2-羟基-1，4萘醌添加浓度为1、2、10、20 mg/kg）通过加入25 mL的去离子水，振荡萃取30 min后离心15 min，上清液直接用HPLC测定，该方法的回收率为70.24%～7712%[6]，尽管胡桃醌与2-羟基-1，4萘醌同属萘醌类化合物，但由于-OH基团的位置不同，使得它们的水溶性差别较大，因此在提取土壤中的胡桃醌时，不宜采用水作为提取溶剂。王文泽等用多种提取溶剂提取核桃楸青果皮中胡桃醌，发现以乙酸乙酯作为提取溶剂时提取率较高，达到0404%[7]。季宇彬等使用多种溶剂从青龙衣中提取胡桃醌，发现乙酸乙酯的提取率最好[8]。程力惠等用乙醇提取核桃球树皮中的胡桃醌，发现超声提取比冷浸法和回流法提取率高[9]。Yang等用氯仿对东北核桃种植园土壤、松叶林土壤以及核桃-松叶林植被间土壤中的胡桃醌进行提取，测得胡桃醌回收率分别为87.1%、85.4%、86.2%[10]。De Scisciolo等在提取不同季节胡桃树下土壤中胡桃醌含量时采用甲醇-冰乙酸作为提取溶剂，提取效果较好[11]。索绪斌等使用高效液相色谱法测定青龙衣中的胡桃醌含量，该方法灵敏度高、准确性与重现性好[12]。孙墨珑等使用分光光度法测定胡桃树皮中胡桃醌含量，方法简单、易操作[13]。孙墨珑等采用 GC-MS 联用法对胡桃树皮中胡桃醌进行测定，该方法灵敏度高、准确性好[14]。本研究在前人研究的基础上，建立了高效液相色谱法测定胡桃醌在土壤中的残留分析方法，本方法操作简单，准确度、精密度、灵敏度均满足农药残留分析的要求，可用于土壤中胡桃醌残留量的测定。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；RE-2000A旋转蒸发仪、YRDC-0506低温冷却循环泵、SHZ-Ⅲ循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；HY-8调速多用振荡箱（常州国华电器有限公司）；SG5200HDT超声波清洗仪（上海冠特超声仪器有限公司）；DT500A电子天平（常熟市意欧仪表有限公司）；移液枪（GILSON）；具塞三角瓶、茄形瓶、抽滤瓶、布氏漏斗以及其他常规实验室设备。
胡桃醌标准品（99%，国家农药产品质检中心），甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司），乙酸乙脂（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）。
1.2试验材料
本试验以黄壤、石灰土、水稻土作为供试土壤，其中黄壤采于贵州省清镇市中八茶园；水稻土采于贵州省平坝县稻田；石灰土采于贵州省关岭县花江旱地。土壤样品采集后，摊成2 cm厚的薄层，间断地压碎、翻拌，拣出碎石、砂砾及植物残体等杂质，置于室温自然晾干后，磨碎过2 mm筛，4 ℃冰箱保存备用。土壤的理化性质见表1。
1.3试验方法
1.3.1样品处理称取20.0 g 土壤（黄壤、水稻土、石灰土）于250 mL的具塞三角瓶中，加入120 mL乙酸乙酯于三角瓶中，置于振荡器中振荡（转速190 r/min）提取60 min，抽滤并用5 mL乙酸乙酯洗涤残渣，合并提取液，旋转至干后加 5 mL 甲醇充分溶解，过0.45 μm有机滤膜，HPLC定量分析。
1.3.2色谱条件色谱柱：Thermo scientific BETASIL-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流动相：甲醇 ∶水=4 ∶1（体积比）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测器：PAD；检测波长：250 nm；进样体积10 μL。 1.3.3标准曲线准确称取0.101 0 g（准确至0.1 mg）胡桃醌（纯度为99%）于称量瓶中，用甲醇少量多次溶解后，将其定量转入100 mL 容量瓶中，定容、摇匀后即得 1 000 mg/L 的胡桃醌储备液，冷藏备用。分别量取不同体积的母液，配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的标准溶液系列，以胡桃醌的质量浓度为横坐标（x）、响应的峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。
1.3.4准确度和精密度试验方法的准确度和精密度通过添加回收率和变异系数来表示[15]。3种土壤均分别加入质量分数为50.0、500.0 mg/L的胡桃醌标准溶液0.40 mL，使胡桃醌质量分数分别为1.0、10.0 mg/kg，每组设定5个平行，样品经处理后，用HPLC法测定3种土壤中的胡桃醌残留量。
1.3.5检出限和定量限方法的检出限为空白样品（待测目标物含量最低样品）多次平行测定（n>5）的标准偏差的3倍所对应的浓度。
2结果与分析
2.1提取溶剂的选择
本研究在前人试验的基础上比较了5种溶剂（甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇 ∶乙酸（11 ∶1，体积比）的提取回收率（表2），回收率试验结果表明，乙酸乙酯、三氯甲烷和乙腈的提取回收率较高，均能满足回收率试验要求，相比较而言，乙酸乙酯、三氯甲烷的回收率最好。考虑到三氯甲烷毒性较大，一般在实验室内应尽量少使用，因此选择土壤中胡桃醌的提取溶剂时，以乙酸乙酯为佳。
2.2标准曲线与线性范围
胡桃醌的峰面积和浓度具有良好线性相关性，线性方程y=35 288x 4 108.7，r=0.999 9，标准曲线见图1。2.0 mg/L 胡桃醌标准溶液的色谱图见图2，胡桃醌的保留时间约为4.2 min，最小检出量为5.0×10-9 g。
2.3仪器的精密度
待基线稳定后连续对同一浓度的标样（2.0 mg/L）进行6次平行测定，进样量为10 μL，其结果见表3。连续6次重复测定胡桃醌含量的变异系数为0.01%，保留时间变异系数为0.002%，说明该方法重现性好，仪器的精密度高。
2.4准确度和精密度结果
由表4可以看出，胡桃醌在黄壤、水稻土、石灰中的平均添加回收率分别为85.5%～86.6%、76.0%～89.1%、781%～84.6%，RSD分别为6.3%～8.2%、2.0%～5.9%、2.5%～3.4%，方法的准确度和精密度均满足农药残留分析的要求[16]，胡桃醌在土壤中的空白回收率色谱图、添加色谱图分别见图3、图4。
2.5方法的检出限和定量限
本方法中胡桃醌的最小检出量为5.0 ng，土壤中的最小检出浓度（LOQ）为1.0 mg/kg。
3结论
本研究结合了前人在提取核桃楸青果皮中胡桃醌时所选用的提取溶剂 通过试验最终选取如下方法测定土壤中胡桃表4胡桃醌在3种土壤中的平均添加回收率醌含量：以120 mL乙酸乙酯振荡提取60 min，抽滤并用5 mL乙酸乙酯洗涤残渣，合并提取液，旋转至干后加5 mL甲醇充分溶解，过0.45 μm有机滤膜，HPLC定量分析。当胡桃醌的添加质量分数为1.0、10.0 mg/kg，胡桃醌在黄壤、水稻土、石灰土中的添加平均回收率分别为85.5%～86.6%、76.0%～89.1%、78.1%～84.6%，RSD分别为6.3%～8.2%、2.0%～5.9%、2.5%～3.4%，最小检出量为5.0ng，土壤中最小检出浓度为1.0 mg/kg。本方法样品处理简单，准确度、精密度及灵敏度均满足农药残留分析的要求，可用于土壤中胡桃醌残留量的测定。
参考文献：
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[8]季宇彬，严琴琴，曲中原，等. 正交试验法优选青龙衣中胡桃醌的提取工艺[J]. 现代药物与临床，2009，24（3）：151-154.
[9]程力惠，黄晓文. 核桃楸树皮中胡桃醌提取方法及其工艺研究[J]. 亚热带植物科学，2010，39（4）：33-35.
[10]Yang L X，Wang P，Kong C H.Effect of larch （Larix gmelini Rupr.） root exudates on Manchurian walnut（Juglans mandshurica Maxim.）growth and soil juglone in a mixed-species plantation[J]. Plant Soil，2010，329：249-258.
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[12]索绪斌，高奎滨，张云凌，等. 高效液相色谱法测定青龙衣中胡桃醌含量[J]. 中药材，2003，26（11）：793.
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[14]孙墨珑，宋湛谦，方桂珍，等. 减压蒸馏法提取核桃楸树皮中的胡桃醌[J]. 林产化学与工业，2007，27（6）：113-115.
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