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摘要：纳米孔检测单个DNA碱基的挑战在于DNA通过纳米孔的速度过快以至于无法获得有效的数据点。本文通过绑定磁珠来降低DNA的易位速度，DNA分子是通过非共价链霉亲和素-生物素键连接在磁珠上，并证明在800mV电压下，被捕获的DNA与磁珠会断裂从而从纳米孔中释放出来。测量绑定磁珠的DNA通过纳米孔的阻塞离子电流轨迹，统计DNA易位事件的持续时间。DNA与磁珠绑定后，DNA易位的速度降低。
关键词：纳米孔；DNA；磁珠；过孔时间
引言
得益于低成本高通量的特性，纳米孔检测技术广泛的应用于快速分析生物分子（DNA，RNA，蛋白质等），以及生物分子之间的相互作用。该技术通过外加电场驱动待测分子通过纳米孔，同时检测单个分子通过纳米孔时引起的离子电流信号变化来分析单分子的性质。纳米孔检测技术能在一秒钟内获得上亿个信号，即不需要标记被检测物，也不需要将分析物锚定在基底上。但是目前该技术面临的瓶颈问题在于，待测分子受电场力驱动通过纳米孔的速度过快。检测过程中，难以采集到足够的电流信号数据点，无法辨识待测分子细微的结构特征。例如，DNA分子在200mV电压驱动下通过固态纳米孔的速度约为30 base/μs[1]。而现有的商品化膜片钳检测系统的最大采样频率为250kHz，每一次采样都会有上百个碱基通过，因此难以根据电流信号的变化分辨出DNA分子上的每一个碱基分子。针对这一问题，Fologea等[2]通过调控偏置电压、溶液浓度、温度以及粘度的方式降低DNA分子的过孔速度。但是这一类方法同时会导致过孔电流信号的幅值降低。直接在待测分子施加与电场力相反的力是实现控制过孔速度的最有效方法。剑桥大学卡文迪实验室的Keyser等[3]人最先设计并搭建了光镊装置，通过在DNA分子上施加机械力达到控制其运动的目的。光镊能够控制DNA分子在纳米孔中的位置达到纳米级精度[4]，该方法还扩展至对蛋白质覆盖的DNA分子[12]以及单根RNA分子[5]的操控。但是光镊系统操控复杂且只能控制单个待测分子，丧失了纳米孔单分子传感器相对于传统单分子检测技术能够实现并行检测的重要优势。与光镊相比，磁镊在理论上可以实现多个待测分子过孔的并行控制[6]。但是目前仍缺乏将DNA绑定在磁珠上后，DNA分子在纳米孔中易位过程的系统研究。
本文通过实验研究了绑定在磁珠的DNA分子在外加电场驱动下通过在纳米孔中的易位过程，观察到将DNA分子绑定在磁珠上能够有效降低其过孔速度，并分析了磁珠影响DNA分子的运动速度机理，以及在磁珠绑定情况下DNA分子的过孔姿态。
1 实验原理和方法
1.1实验原理
实验原理如图1（a）所示，两个充满溶液的液池通过纳米孔相连，将Ag / AgCl电极分别浸入液池中，通过膜片钳放大器在纳米孔两端施加电压，从而形成基准离子电流并驱动DNA分子通过纳米孔。当DNA分子通过纳米孔时，可利用膜片钳放大器（AXON 700B）检测到脉冲离子电流信号。图1（a）中，黄色球状为磁珠，红色链状为DNA分子。DNA分子通过非共价链霉亲和素-生物素键连接到磁珠上。本实验所采用DNA分子为双链lambda DNA（共有48kbp，直径约2.2nm，长度约16.5μm）；磁珠表面修饰链霉亲和素（直径为1.2-1.5μm，购于Sigma公司），其形态如图1（b）所示；本文中使用纳米孔直径为33nm；溶液为1 M KCl（pH=8，缓冲液为10mM Tris-HCl，1mM EDTA）；所有实验均在法拉第笼中完成。
1.2 纳米孔的制备
氮化硅纳米孔的制备首先采用低压化学气相沉积方法（LP CVD）在硅基底两侧分别沉积100nm厚的氮化硅薄膜。通过光刻、反应离子刻蚀（RIE）工艺在氮化硅表面刻蚀出释放窗口。采用质量分数为25%的四甲基氢氧化铵（TMAH）溶液刻蚀释放窗口露出的硅基地，得到自支撑的氮化硅薄膜。利用聚焦离子束（FIB）减薄局部氮化硅膜的厚度。最后，在减薄区域利用FIB制备纳米孔，纳米孔直径的大小取决于刻蚀的时间以及离子束束流大小。为了纳米孔芯片上的有机污染物，降低检测过程中的1/f噪音。制备完成的纳米孔用于实验前需用180℃的食人鱼溶液（体积比V（H2S04）：V（H2O2）=3：1）浸泡20min，之后用去离子水清洗。
1.3 磁珠和DNA分子绑定
DNA分子绑定到磁珠之前需将DNA分子生物素化，即将生物素连接到DNA分子的一端。该过程主要包括杂交、提纯和将专门设计的引物連接到lambda DNA的cos位点 [7]。杂交主要运用聚合酶链式反应（PCR）技术，它类似于DNA的天然复制过程。完成杂交后的DNA包含酶和引物等杂质，需要提纯。DNA提纯主要是用苯酚-氯仿法，其原理是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性。最后，在生物素化的DNA溶液中加入5μL的磁珠悬浮液和100mL缓冲液（100mM KCl，10mM Tris-EDTA），在室温下静置15分钟，即完成磁珠和DNA的绑定。
2 实验结果与讨论
首先，将绑定DNA分子的磁珠加入cis侧液池，施加800mV偏置电压，检测到的离子电流信号如图3（a）所示，出现了大量下降的脉冲信号，说明出现了分子过孔事件。由于磁珠的体积远大于纳米孔，无法通过纳米孔，因此绑定在磁珠上的DNA通过纳米孔的前提是DNA能够与磁珠分离。磁珠表面的聚苯乙烯通过共价键与链霉亲和素连接，DNA通过共价键与单个生物素分子连接，然后它们通过非共价链霉亲和素-生物素键连接。因此，DNA分子与磁珠绑定结构中非共价链霉亲和素-生物素键是最薄弱的一环[8]。
Merkel等人[9]使用原子力显微镜（AFM）对链霉亲和素-生物素键的强度进行了测试，实验表明链霉亲和素-生物素键的强度在5～170pN。当缓冲液为浓度范围在0.02～1M的氯化钾盐溶液时，单个DNA分子上所受到的力与外加电势成正比关系，其中，比例系数约为0.24±0.02pN mV-1。在本实验中，电压为800mV，可以估计出DNA分子受到的力约为192pN。因此，可以认为DNA分子在电场力作用下进入纳米孔，导致链霉亲和素-生物素键断裂，挣脱与磁珠的绑定。通过统计发现绑定磁珠的DNA分子平均过孔时间为24.25 ms，即平均速度为0.68 μm/ms。因此，仅仅将DNA绑定在磁珠上可以有效降低DNA易位过孔的速度约两个数量级。主要原因两个方面。首先，由于磁珠在溶液中无法被电场驱动，DNA分子的运动会受到来自磁珠的反向拖拽力；其次，磁珠的体积远大于纳米孔，DNA分子只有挣脱与磁珠的绑定才能通过纳米孔。 3 结 论
本文研究分析了自由状态的DNA分子以及綁定在磁珠的DNA分子在外加电场驱动下通过在纳米孔中的易位过程。实验发现将DNA绑定在磁珠上可以有效降低DNA易位过孔的速度。
参考文献
[1]Zhang H，Zhao Q，Tang Z，et al. Slowing down DNA translocation through solid-state nanopores by pressure[J]. Small，2013，9（24）：4112-7.
[2]Fologea，D.，et al.，Slowing DNA translocation in a solid-state nanopore. Nano Letters，2005. 5（9）：p. 1734-1737.
[3]Keyser，U.F.，et al.，Direct force measurements on DNA in a solid-state nanopore. Nature Physics，2006. 2（7）：p. 473-477.
[4]Sischka，A.，et al.，Single beam optical tweezers setup with backscattered light detection for three-dimensional measurements on DNA and nanopores. Rev Sci Instrum，2008. 79（6）：p. 063702.
[5]Hall，A.R.，et al.，Electrophoretic Force on a Protein-Coated DNA Molecule in a Solid-State Nanopore. Nano Letters，2009. 9（12）：p. 4441-4445.
[6]Van den Hout，M.，et al.，Direct Force Measurements on Double-Stranded RNA in Solid-State Nanopores. Nano Letters，2010. 10（2）：p. 701-707.
[7]Peng，H.B. and X.S.S. Ling，Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology，2009. 20（18）.
[8]Peng H，Ling X S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers.[J]. Nanotechnology，2009，20（18）：185101.
[9]Merkel R，Nassoy P，Leung A，et al. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.[J]. Nature，1999，397（6714）：50-3.
（作者单位：东南大学机械工程学院）
关键词：纳米孔；DNA；磁珠；过孔时间
引言
得益于低成本高通量的特性，纳米孔检测技术广泛的应用于快速分析生物分子（DNA，RNA，蛋白质等），以及生物分子之间的相互作用。该技术通过外加电场驱动待测分子通过纳米孔，同时检测单个分子通过纳米孔时引起的离子电流信号变化来分析单分子的性质。纳米孔检测技术能在一秒钟内获得上亿个信号，即不需要标记被检测物，也不需要将分析物锚定在基底上。但是目前该技术面临的瓶颈问题在于，待测分子受电场力驱动通过纳米孔的速度过快。检测过程中，难以采集到足够的电流信号数据点，无法辨识待测分子细微的结构特征。例如，DNA分子在200mV电压驱动下通过固态纳米孔的速度约为30 base/μs[1]。而现有的商品化膜片钳检测系统的最大采样频率为250kHz，每一次采样都会有上百个碱基通过，因此难以根据电流信号的变化分辨出DNA分子上的每一个碱基分子。针对这一问题，Fologea等[2]通过调控偏置电压、溶液浓度、温度以及粘度的方式降低DNA分子的过孔速度。但是这一类方法同时会导致过孔电流信号的幅值降低。直接在待测分子施加与电场力相反的力是实现控制过孔速度的最有效方法。剑桥大学卡文迪实验室的Keyser等[3]人最先设计并搭建了光镊装置，通过在DNA分子上施加机械力达到控制其运动的目的。光镊能够控制DNA分子在纳米孔中的位置达到纳米级精度[4]，该方法还扩展至对蛋白质覆盖的DNA分子[12]以及单根RNA分子[5]的操控。但是光镊系统操控复杂且只能控制单个待测分子，丧失了纳米孔单分子传感器相对于传统单分子检测技术能够实现并行检测的重要优势。与光镊相比，磁镊在理论上可以实现多个待测分子过孔的并行控制[6]。但是目前仍缺乏将DNA绑定在磁珠上后，DNA分子在纳米孔中易位过程的系统研究。
本文通过实验研究了绑定在磁珠的DNA分子在外加电场驱动下通过在纳米孔中的易位过程，观察到将DNA分子绑定在磁珠上能够有效降低其过孔速度，并分析了磁珠影响DNA分子的运动速度机理，以及在磁珠绑定情况下DNA分子的过孔姿态。
1 实验原理和方法
1.1实验原理
实验原理如图1（a）所示，两个充满溶液的液池通过纳米孔相连，将Ag / AgCl电极分别浸入液池中，通过膜片钳放大器在纳米孔两端施加电压，从而形成基准离子电流并驱动DNA分子通过纳米孔。当DNA分子通过纳米孔时，可利用膜片钳放大器（AXON 700B）检测到脉冲离子电流信号。图1（a）中，黄色球状为磁珠，红色链状为DNA分子。DNA分子通过非共价链霉亲和素-生物素键连接到磁珠上。本实验所采用DNA分子为双链lambda DNA（共有48kbp，直径约2.2nm，长度约16.5μm）；磁珠表面修饰链霉亲和素（直径为1.2-1.5μm，购于Sigma公司），其形态如图1（b）所示；本文中使用纳米孔直径为33nm；溶液为1 M KCl（pH=8，缓冲液为10mM Tris-HCl，1mM EDTA）；所有实验均在法拉第笼中完成。
1.2 纳米孔的制备
氮化硅纳米孔的制备首先采用低压化学气相沉积方法（LP CVD）在硅基底两侧分别沉积100nm厚的氮化硅薄膜。通过光刻、反应离子刻蚀（RIE）工艺在氮化硅表面刻蚀出释放窗口。采用质量分数为25%的四甲基氢氧化铵（TMAH）溶液刻蚀释放窗口露出的硅基地，得到自支撑的氮化硅薄膜。利用聚焦离子束（FIB）减薄局部氮化硅膜的厚度。最后，在减薄区域利用FIB制备纳米孔，纳米孔直径的大小取决于刻蚀的时间以及离子束束流大小。为了纳米孔芯片上的有机污染物，降低检测过程中的1/f噪音。制备完成的纳米孔用于实验前需用180℃的食人鱼溶液（体积比V（H2S04）：V（H2O2）=3：1）浸泡20min，之后用去离子水清洗。
1.3 磁珠和DNA分子绑定
DNA分子绑定到磁珠之前需将DNA分子生物素化，即将生物素连接到DNA分子的一端。该过程主要包括杂交、提纯和将专门设计的引物連接到lambda DNA的cos位点 [7]。杂交主要运用聚合酶链式反应（PCR）技术，它类似于DNA的天然复制过程。完成杂交后的DNA包含酶和引物等杂质，需要提纯。DNA提纯主要是用苯酚-氯仿法，其原理是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性。最后，在生物素化的DNA溶液中加入5μL的磁珠悬浮液和100mL缓冲液（100mM KCl，10mM Tris-EDTA），在室温下静置15分钟，即完成磁珠和DNA的绑定。
2 实验结果与讨论
首先，将绑定DNA分子的磁珠加入cis侧液池，施加800mV偏置电压，检测到的离子电流信号如图3（a）所示，出现了大量下降的脉冲信号，说明出现了分子过孔事件。由于磁珠的体积远大于纳米孔，无法通过纳米孔，因此绑定在磁珠上的DNA通过纳米孔的前提是DNA能够与磁珠分离。磁珠表面的聚苯乙烯通过共价键与链霉亲和素连接，DNA通过共价键与单个生物素分子连接，然后它们通过非共价链霉亲和素-生物素键连接。因此，DNA分子与磁珠绑定结构中非共价链霉亲和素-生物素键是最薄弱的一环[8]。
Merkel等人[9]使用原子力显微镜（AFM）对链霉亲和素-生物素键的强度进行了测试，实验表明链霉亲和素-生物素键的强度在5～170pN。当缓冲液为浓度范围在0.02～1M的氯化钾盐溶液时，单个DNA分子上所受到的力与外加电势成正比关系，其中，比例系数约为0.24±0.02pN mV-1。在本实验中，电压为800mV，可以估计出DNA分子受到的力约为192pN。因此，可以认为DNA分子在电场力作用下进入纳米孔，导致链霉亲和素-生物素键断裂，挣脱与磁珠的绑定。通过统计发现绑定磁珠的DNA分子平均过孔时间为24.25 ms，即平均速度为0.68 μm/ms。因此，仅仅将DNA绑定在磁珠上可以有效降低DNA易位过孔的速度约两个数量级。主要原因两个方面。首先，由于磁珠在溶液中无法被电场驱动，DNA分子的运动会受到来自磁珠的反向拖拽力；其次，磁珠的体积远大于纳米孔，DNA分子只有挣脱与磁珠的绑定才能通过纳米孔。 3 结 论
本文研究分析了自由状态的DNA分子以及綁定在磁珠的DNA分子在外加电场驱动下通过在纳米孔中的易位过程。实验发现将DNA绑定在磁珠上可以有效降低DNA易位过孔的速度。
参考文献
[1]Zhang H，Zhao Q，Tang Z，et al. Slowing down DNA translocation through solid-state nanopores by pressure[J]. Small，2013，9（24）：4112-7.
[2]Fologea，D.，et al.，Slowing DNA translocation in a solid-state nanopore. Nano Letters，2005. 5（9）：p. 1734-1737.
[3]Keyser，U.F.，et al.，Direct force measurements on DNA in a solid-state nanopore. Nature Physics，2006. 2（7）：p. 473-477.
[4]Sischka，A.，et al.，Single beam optical tweezers setup with backscattered light detection for three-dimensional measurements on DNA and nanopores. Rev Sci Instrum，2008. 79（6）：p. 063702.
[5]Hall，A.R.，et al.，Electrophoretic Force on a Protein-Coated DNA Molecule in a Solid-State Nanopore. Nano Letters，2009. 9（12）：p. 4441-4445.
[6]Van den Hout，M.，et al.，Direct Force Measurements on Double-Stranded RNA in Solid-State Nanopores. Nano Letters，2010. 10（2）：p. 701-707.
[7]Peng，H.B. and X.S.S. Ling，Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology，2009. 20（18）.
[8]Peng H，Ling X S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers.[J]. Nanotechnology，2009，20（18）：185101.
[9]Merkel R，Nassoy P，Leung A，et al. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.[J]. Nature，1999，397（6714）：50-3.
（作者单位：东南大学机械工程学院）