TMEM33 mRNA 3′-UTR报告基因载体的构建及功能验证

• 作 者: 冯胜娟 吕晓武 刘真 李文婷 吴玉家 张亚洁 王瑞晨 曺令 邱亚斌 贾赤宇
• 机 构: 解放军第三○九医院烧伤整形科,北京,100091
• 出 处: 感染、炎症、修复
• 发表日期: 2014年4期
• 关键词: TMEM33 荧光素酶报告基因 微小 RNA-146a 肺损伤 吸入性

目的：：根据microRNA-146a(miR-146a)预测靶点构建荧光素酶报告基因重组质粒并进行功能验证,为研究吸入性损伤中 miR-146a通过靶向跨膜蛋白33(TMEM33)对 Toll 样受体/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信号通路的调控作用提供前期的工作基础。方法：通过生物学软件预测 TMEM33 mRNA 3′端非翻译区(TMEM33 mRNA 3′-UTR)可能是miR-146a的作用靶点,将设计合成的TMEM33及其突变序列TMEM33-mu序列分别克隆至荧光素酶报告质粒,采用脂质体法将这两种重组荧光素酶报告质粒 pMIR-TMEM33和 pMIR-TMEM33-mu分别与miR146a mimics共转染 HEK-293T细胞,以 pMIR-TMEM33+miR-control 转染 HEK-293细胞作对照,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果：TargetScan 和 miRanda 软件预测显示,miR-146a 与TMEM33 mRNA 3′-UTR存在互补结合位点,构建的荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测系统显示,miR-146a对TMEM33 mRNA 3′-UTR 具有靶向作用,pMIR-TMEM33+miR146a mimics组较 pMIR-TMEM33+miR-control 组荧光素酶活性降低62%左右,差异具有统计学意义(P0.05)。结论：成功构建 TMEM33mRNA 3′-UTR 荧光素酶报告载体,证实 miR-146a对TMEM33 mRNA 3′-UTR具有靶向调控作用,为从基因水平深入揭示吸入性肺损伤发病机制提供实验室数据和方法。